[发明专利]一种改良的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的分离制备方法

摘要

本发明公开了一种改良的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞的分离制备方法。包括如下主要步骤：1)以复合酶短暂消化去除大鼠胸主动脉血管的内、外膜层，保证中膜层的完整性；2)以一小时的复合酶消化释放、分散和制备胸主动脉VSMC；3)获得高产量、活力佳、可传代的收缩型大鼠胸主动脉VSMC。本发明方法所分离的胸主动脉VSMC活性高、纯度好；分离步骤简单、耗时短、成功率高，适用于初学者的操作。

主权项

1.一种改良的大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞VSMC的分离制备方法，通过二步复合酶消化释放大鼠胸主动脉VSMC制备大鼠胸主动脉收缩型血管平滑肌细胞VSMC,包括如下步骤:1)取乙醚麻醉大鼠，迅速剪取其胸主动脉；2)反复冲洗胸主动脉，去掉其表面粘附的凝血等组织块；3)剔净血管的周围组织，然后放入复合酶液中、在37℃的气浴恒温振荡器里消化45分钟，随后剥离血管外膜层、刮除内膜层和剥离中膜层；4)以含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS漂洗分离的中膜层，置于干净的培养皿进行快速剪碎为1‑2mm³，然后转入放有复合酶液的6孔板内、并于孵箱中37℃、5％CO₂，消化1小时；5)终止消化，用10ml的注射器抽打组织消化液直至细胞基本从组织残片中脱离，再用细胞筛过滤获得悬液；取滤网上的组织，重复抽打和过滤，将多次过滤后的细胞悬液一起转移到15ml的离心管里，1000转/分、离心5分钟收集细胞；6)取含20％FBS的DMEM悬浮细胞，种入6孔板进行培养；其特征在于，其步骤3)中复合酶液的配制：以HBSS新鲜配制含有浓度为1mg/ml二型胶原酶、浓度为1mg/ml胰蛋白酶抑制剂和浓度为7.08μl/ml胰肽酶的复合酶液；复合酶液配方及用法：Ⅱ型胶原酶1mg/ml，胰蛋白酶抑制剂1mg/ml，胰肽酶7.08μl/ml，以含Ca²⁺、Mg²⁺的HBSS为溶剂，定容为1ml；每条大鼠胸主动脉平均每次取1ml复合酶进行消化。