[发明专利]一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法

摘要

本发明公开一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法，通过木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的水解以及特定的纯化工艺，获得胶原蛋白活性肽。该胶原蛋白活性肽具有抑制癌细胞增殖的作用，如卵巢癌细胞，包括SKOV3、OVCAR3、436和SRO82，前列腺癌细胞，包括PC3、LnCAPC1、LnCAPC2。

主权项

1.一种具有抑制癌细胞增殖作用的胶原蛋白活性肽的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：1）将明胶用水配制成浓度为10‑25%的明胶溶液；其中，所述明胶选自牛骨明胶或猪骨明胶；2）将所述明胶溶液加热至40‑75℃，调节pH至5.0‑6.5；加入木瓜蛋白酶进行酶解，获得第一酶解反应液，其中，所述木瓜蛋白酶的酶量为干明胶质量的1‰‑2%，酶解时间总计为30分钟‑4小时；3）调节所述第一酶解反应液的温度至40‑75℃，调节pH至7.0‑8.5，加入胰蛋白酶，获得第二酶解反应液，其中，所述胰蛋白酶加入量为干明胶质量的1‰‑2%，酶解时间为30分钟‑4小时；4）调节第二酶解反应液的pH至5.5‑6.5；5）灭活第二酶解反应液中的蛋白酶；然后冷却第二酶解反应液至40℃以下，得到粗产物溶液；6）过滤所述粗产物溶液；7）用截留分子量为1500Da的超滤膜过滤所述粗产物溶液，获得第一透过液；8）用截留分子量为300Da的超滤膜浓缩所述第一透过液，获得浓缩液，冷冻干燥；9）采用阳离子交换柱对步骤8）的干燥产物进行纯化，具体步骤是：取30mg胶原蛋白肽粉末溶于1mL起始缓冲液A中，注入1mL样品环，用5mL GE公司的HitrapTMSP HP预装柱进行分离，具体地分离过程为：用起始缓冲液A 平衡3个柱体积，即15ml；上样后，用起始缓冲液A柱洗2个柱体积，即10mL；用洗脱缓冲液B线性梯度洗脱20个柱体积，即100mL；用起始缓冲液平衡5个柱体积；所有试验过程均在AVANT150 上完成，检测波长为220nm，缓冲液流速为1mL/min，收集保留时间为tR=7.5min位置的穿透峰，然后用真空干燥的方式干燥纯化产物，得到含盐的胶原蛋白肽产品；其中，所述起始缓冲液A为PH=5的50mM醋酸钠溶液，所述洗脱缓冲液B为PH=5的50mM醋酸钠缓冲液与2M NaCl的混合溶液；10）采用凝胶柱层析对步骤9）得到的纯化产物进行脱盐处理，获得胶原蛋白活性肽溶液，具体步骤是：用超纯水平衡一个柱体积，流速为1mL/min，将1mL浓度为25mg/mL的含盐胶原蛋白肽注入样品环，用超纯水洗脱0.8个柱体积，流速为1mL/min，所有实验过程在AVANT 150上完成，检测波长为220nm，收集保留时间tR=75min位置的峰；11）对步骤10）得到的胶原蛋白活性肽溶液进行冷冻干燥，得粉末状胶原蛋白活性肽。