[发明专利]一种二/三甲基化肽段富集和质谱分析的方法

摘要

本发明属蛋白质分析技术领域，具体为一种二/三甲基化（Kme2/3）修饰肽段富集和质谱分析的方法。本发明方法包括：对蛋白上未修饰（Kme0）或者单甲基化（Kme1）修饰的赖氨酸进行衍生化使其带上生物素标记，再将蛋白酶解成肽段后，再加入亲和素偶联的琼脂糖微球，通过生物素和亲和素之间的高特异和高亲和作用，除去Kme0/1肽段，在上清中保留Kme2/3修饰肽段，最后利用除盐柱捕获上清中的肽段，送入质谱分析质谱分析Kme2/3修饰肽段。本发明方法首次实现对Kme2/3修饰肽段的化学富集，能显著地提高Kme2/3修饰肽段的分析质谱选择性，并且具有特异性强、重现性好、步骤简单、操作方便等特点。

主权项

 一种二/三甲基化肽段富集和质谱分析的方法，其特征在于，利用生物素化试剂（EZ‑NHS‑biotin）基团能够与未修饰（Kme0）或者单甲基化（Kme1）（记为Kme0/1）修饰的赖氨酸发生特异性反应而不会与二、三甲基化（Kme2/3）修饰的赖氨酸反应的特点，通过亲和素偶联的琼脂糖微球去除Kme0/1修饰的赖氨酸肽段，对Kme2/3修饰的赖氨酸肽段进行富集；具体步骤为：（1）蛋白生物素化修饰：基于N‑羟基琥珀酰亚胺与赖氨酸侧链氨基的高效反应，采用生物素化试剂（EZ‑NHS‑biotin），通过化学反应将生物素基团引入赖氨酸Kme0/1上，实现蛋白样品中赖氨酸Kme0/1的高效生物素化修饰；（2）蛋白沉淀：向经步骤（1）生物素化修饰的蛋白样品加入丙酮，过夜，沉淀蛋白，同时去除过量的生物素化试剂；（3）蛋白酶解：向经步骤（2）处理的蛋白中加入胰蛋白酶，胰蛋白酶和蛋白的质量比1:40‑60，充分混合，35‑39摄氏度酶切14‑16小时，使蛋白完全酶解成氨基酸长度在10‑20之间的的肽段；（4）亲和素去除生物素修饰肽段：用缓冲液稀释肽段至1‑1.5ml，用亲和素偶联的琼脂糖微球为吸附剂，利用亲和素和生物素之间的高亲和能力，将生物素化的Kme0/1吸附到亲和素偶联的琼脂糖微球上，亲和吸附过程在2‑6摄氏度条件下进行，时间2‑4小时，充分去除发生生物素修饰的Kme0/1修饰肽段；（5）质谱分析：600‑1200g离心后取上清，通过除盐柱富集上清中的肽段，冻干，然后进行质谱检测。