[发明专利]一种基于人源骨架蛋白Fn3制备脑钠肽前体抗原替代物的方法

摘要

本发明公开一种应用人源骨架蛋白Fn3(人纤维连接蛋白fibronectin 3)展示抗原表位用于制备脑钠肽前体N端(NT‑proBNP)线性表位的方法。该方法通过基因重组，将能与抗脑钠肽前体抗体结合的抗原表位核苷酸序列置换骨架蛋白Fn3的编码FG区的核苷酸序列，构成骨架蛋白Fn3与NT‑proBNP线性表位融合基因，利用大肠杆菌表达系统高效表达、制备骨架蛋白Fn3融合NT‑proBNP线性表位的融合蛋白。本发明的有益效果是可以简单、快速、高效制备具有和脑钠肽前体的抗原性相当的融合蛋白，为高效低成本制备具有脑钠肽前体抗原性的标准品奠定基础。

主权项

1.一种基于人源骨架蛋白Fn3制备脑钠肽前体抗原替代物的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)、骨架蛋白Fn3展示NT‑proBNP线性表位重组蛋白表达载体构建：(1)根据Fn3骨架蛋白晶体结构，设计展示表位位置，根据模建结果，将NT‑proBNP线性表位设计在Fn3骨架蛋白的FG区，将能与抗脑钠肽前体抗体结合的抗原表位核苷酸序列置换骨架蛋白Fn3的编码FG区的核苷酸序列，构成骨架蛋白Fn3与NT‑proBNP线性表位融合基因，合成Fn3展示NT‑proBNP线性表位的基因片段，在融合基因下游融合编码6个组氨酸的分离纯化标签(His‑tag)，便于分离纯化：采用人纤维连接蛋白III型结构域(Fn3)蛋白为模式基因，在基因的5′末端引入编码6个组氨酸残基，在FG loop区引入NT‑proBNP编码表位的核苷酸序列CTGGAAACCTCGGGCCTGCAGGAACAACGT，以上设计合成的基因编码Fn3展示NT‑proBNP线性表位重组蛋白， 命名为Fn3‑epitope；(2)将以上融合基因构建到大肠杆菌胞内表达载体上，融合的重组蛋白将在大肠杆菌胞内表达：将上述设计合成的基因，用Nco I和Hind III构建到大肠杆菌表达载体pET28a(+)上，得到重组载体pET28‑Fn3‑epitope；2)、将构建的重组蛋白基因质胞内表达载体转化到大肠杆菌工程菌株，筛选得到阳性克隆，此阳性克隆表达的重组蛋白就展示有线性抗原表位，将鉴定过的阳性转化子进行自诱导表达，诱导表达3‑6小时，培养基中添加与表达载体所带抗性基因相应的抗生素；将构建的表达载体电击转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)，然后将转化子接种到10毫升含有Kan的LB培养基中，过夜培养，次日，以1:100接种到500毫升含有Kan的LB培养基的2升三角瓶中，200rpm、37℃培养，直至OD600达到0.6，然后，在25‑35℃、200rpm条件下添加1毫摩尔的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达3小时，在此过程，在大肠杆菌胞内表达重组蛋白；其中，Kan的浓度为每毫升LB培养基中含50微克卡那霉素；LB培养基的配方为： 胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L；3)、收集菌体，提取可溶蛋白，用亲和层析方法，分离纯化重组蛋白，该蛋白即为包含有线性抗原表位的融合蛋白：用镍柱纯化His‑Tag的重组蛋白，得到纯化的重组蛋白Fn3‑epitope。