[发明专利]高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法

摘要

高产2,3-丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法及其发酵方法，涉及一种高产2,3-丁二醇的基因工程菌株的构建方法及其发酵方法。本发明是为了解决目前产酸克雷伯氏菌产2,3-丁二醇产量低、转化率低、生产强度低及纯度低的问题。构建方法：一、ldh基因同源左臂片段ldh-L和右臂片段ldh-R的构建；二、pldh-L和pldh-R质粒构建；三、pldh-LR质粒构建；四、pT-Cm^r质粒构建；五、同源重组片段ldhL-Cm^r-ldhR的构建；六、K.oxytoca HD79/pKD46菌株构建；七、ldhL-Cm^r-ldhR转化K.oxytoca HD79/pKD46。发酵方法：一、将产酸克雷伯氏基因工程菌株接种到种子培养基中，培养至对数生长期，得种子液；二、将种子液接种到发酵培养基中，底物葡萄糖150g/L，发酵，结束。本发明用于生产2,3-丁二醇。

主权项

高产2,3‑丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株的构建方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：一、ldh基因同源左臂片段ldh‑L和右臂片段ldh‑R的构建：以产酸克雷伯氏菌HD79基因组DNA为模板，分别用ldh‑L₁、ldh‑L₂和ldh‑R₁、ldh‑R₂引物进行PCR反应；二、pldh‑L和pldh‑R质粒构建：向含有ldh基因同源左臂片段和右臂片段的PCR反应体系中加入0.25μL 5U/μL的TaqDNA聚合酶，72℃水浴中反应10min，将目的条带胶回收纯化，获得片段ldh‑L和ldh‑R，将片段ldh‑L和ldh‑R分别与pMD18‑T载体连接，获得克隆载体分别命名为pldh‑L和pldh‑R；三、pldh‑LR质粒构建：以pldh‑L为骨架，选用限制性内切酶Xho I和EcoR I对质粒载体pldh‑L与pldh‑R分别进行双酶切，用T4DNA连接酶将pldh‑R的酶切产物连接到pldh‑L质粒载体上，得到重组质粒pldh‑LR；四、pT‑Cm^r质粒构建：以pGP704‑Cm为模板，利用Cm‑up和Cm‑down为扩增引物，对Cm^r进行PCR扩增，对PCR产物进行TA克隆，得到pT‑Cm^r质粒；五、同源重组片段ldhL‑Cm^r‑ldhR的构建：以重组质粒pldh‑LR为骨架，选用限制性内切酶Xho I对重组质粒pT‑Cm^r和pldh‑LR进行酶切，将获得的Cm^r片段插入质粒载体pldh‑LR中，构建质粒载体pT‑LCR；选择限制性内切酶BamH I与Bgl II对重组质粒pT‑LCR进行酶切，获得同源重组片段ldhL‑Cm^r‑ldhR；六、K.oxytoca HD79/pKD46菌株构建：将质粒pKD46电转化到K.oxytoca HD79感受态细胞，得到K.oxytoca HD79/pKD46菌株；七、同源重组片段ldhL‑Cm^r‑ldhR转化K.oxytoca HD79/pKD46：将同源重组片段ldhL‑Cm^r‑ldhR电转化到K.oxytoca HD79/pKD46中，得到的目的菌株为高产2,3‑丁二醇的产酸克雷伯氏基因工程菌株K.ocytoca HD79‑01。