[发明专利]固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法

摘要

本发明公开了一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，包括以下步骤：(1)将ATP生产酶固定于固定化载体上，制备固定化ATP生产酶；(2)利用固定化ATP生产酶，催化制备三磷酸腺苷反应液；以及(3)分离产物三磷酸腺苷(ATP)。本发明采用新型Ppk、Adk、Pap三种ATP生产酶，只需两步酶促反应即可合成ATP，反应过程更简单，反应更容易控制，产品质量更加稳定；采用固定化酶催化的方法制备ATP，固定化酶可连续、反复多次使用，大幅的降低了生产成本。同时避免了使用酵母引入的大量蛋白、色素等杂质，更加易于纯化；建立了适用于大规模生产ATP的间歇搅拌反应及酶反应柱连续反应体系。

主权项

1.一种固定化酶法制备三磷酸腺苷的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)制备ATP生产酶：制备高表达Ppk、Pap菌株，经发酵完成后离心收集菌体；分别取含Pap的菌体2.0kg，含Ppk的菌体2.0kg，用20L 0.1M pH7.5 Tris盐酸缓冲液混溶悬浮后，用高压均质机破碎菌，离心收集上清即得ATP生产酶；(2)固定化ATP生产酶：在恒温搅拌反应罐中加入含氨基合成高聚物载体LX1000HA 5kg与上述ATP生产酶20L混合，在20℃条件下，150rpm搅拌12h；过滤收集载体，用0.02M pH 8.0磷酸钾缓冲液清洗2遍，得固定化ATP生产酶；(3)在200L反应罐中配制总体积100L的反应液，含AMP 40mM，含六偏磷酸0.75M，含硫酸镁25mM，余量为水；用NaOH调节反应液的pH至7.0，加入上述固定化ATP生产酶5kg，在37℃下150rpm开始搅拌反应，反应5h后，经高效液相色谱检测ATP的生成量；反应后的溶液经滤袋回收固定化ATP生产酶，透过液经层析分离结晶干燥后，获得三磷酸腺苷干品1.7kg。