[发明专利]一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法

摘要

本发明公开了一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法，该方法包括以下步骤操作准备、培养基形成、培养容器回温、培养容器消毒、干细胞解冻、离心去冷冻保护剂、干细胞与培养基按比混合、干细胞恢复性培养孵育、加入台盼蓝活性染料、观察干细胞存活情况、干细胞初步筛选、以及干细胞全基因筛查。本发明的有益效果是，通过将解冻后的干细胞放入带有小分子肽成份的新鲜培养基中进行恢复性培养孵育，极大限度上提高了干细胞的复苏率；然后通过台盼蓝活性染料将一部分已经死亡的干细胞进行初步筛选；最好再利用染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，对干细胞进行PGS与PGD全基因筛查诊断，以得到干细胞的健康程度进而判断其可用性。

主权项

一种冻存口腔干细胞可用性筛检的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：步骤S001、操作人员将手洗净并用消毒水消毒，或者戴上消毒处理后的手套；步骤S002、自液氮或干冰容器中取出洁净的培养容器，并将由干细胞无血清基础培养基、小分子肽、及螺旋藻混合所组成的新鲜培养基倒入该培养容器内；步骤S003、将装有上述步骤S002中所述新鲜培养基的所述培养容器快速置于37℃恒温水槽中进行回温；步骤S004、将上述步骤S003中回温后的所述培养容器用酒精含量达65％以上的酒精棉擦拭，擦拭后移入无菌操作台内待用；步骤S005、将冻存有口腔干细胞的冷冻保存管取出，并立即放入37℃恒温水槽中快速解冻，且轻摇所述冷冻保存管使其内部的干细胞在1分钟内全部融化；步骤S006、将经上述步骤S005中解冻后的干细胞悬浮液加入含有上述步骤S002中所述新鲜培养基的离心管内，以1000rpm的转速离心不低于3分钟，然后去除以DMSO或glycerol冷冻保护剂为主要成份的上清液；步骤S007、将经上述步骤S006离心去除冷冻保护剂后的干细胞液缓缓加入经上述步骤S004处理后的所述培养容器内，并将干细胞液与所述新鲜培养基按照1:5～1:10的稀释比进行均匀混合；步骤S008、将上述步骤S007中装有稀释混合后干细胞液的所述培养容器放入培养箱中，对干细胞进行10小时以上的恢复性培养孵育；步骤S009、用洁净试管取出经过上述步骤S008培养孵育后的干细胞10μl，并将10μl台盼蓝活性染料缓缓加入所述洁净试管内与10μl干细胞形成等比混合，轻轻摇晃所述洁净试管使混合充分；步骤S010、将上述步骤S009中干细胞与台盼蓝活性染料的混合溶液缓缓倒入洁净的血球计数盘，盖上玻片，用100倍显微镜观察干细胞存活情况，没有被台盼蓝活性染料染色的干细胞为活细胞，被台盼蓝活性染料染成蓝色或红色的干细胞为死细胞；步骤S011、借助上述步骤S010中的显微镜，用吸附器具将上述步骤S010中所发现的死细胞吸出，实现初步筛选；步骤S012、利用染色质免疫共沉淀基因测序分析技术，对经过上述步骤S011初步筛选后的活干细胞，进行PGS与PGD全基因筛查诊断，以筛检干细胞的健康程度进而判断可用性。