[发明专利]基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法

摘要

本发明涉及一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法，属植物质体基因工程研究技术领域。本发明的方法以四环素基因及四环素特异性识别序列的核心操控区为基础，生物合成带有四环素核心操控区的prrnO1O2启动子，并在原核细胞中验证该启动子的活性，在该启动子的驱动下GFP基因表达；构建四环素诱导表达载体，筛选出适应细菌生长的最高四环素使用浓度为5μg/mL；最后构建四环素调控系统下的GFP表达载体，在未加入四环素时，prrnO1O2启动子的功能被抑制，加入四环素后，GFP基因表达出绿色荧光蛋白。本发明的有益效果在于：利用四环素调控系统控制叶绿体启动子的活性，从而避开了核基因组对质体基因组的调控干扰，为进一步的质体基因工程育种提供有有效的方法和途径。

主权项

一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：a、查阅资料及在NCBI数据库中查得到四环素抗性操纵子的启动子区存在着两个基本相同的操纵序列，两区域能够特异性识别四环素蛋白因子；并根据本Bio3‑GFP表达载体设计本发明中涉及的特异性引物：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、及SEQ ID NO:5，其中：SEQ ID NO:1:和SEQ ID NO:2用于扩增步骤b中的新合成prrnO1O2启动子序列，SEQ ID NO:3:和SEQ ID NO:4用于扩增TetR基因序列，SEQ ID NO:1:和SEQ ID NO:5启动子prrn，将Tet两个核心操纵区嵌入启动子prrn中，单下划线部分为操纵子O1，位于TATA‑box方框标注的上游第2个碱基处；双下划线为部分为操纵子O2，位于prrn启动子转录起始位点A灰色底纹标注下游第3个碱基处；将该启动子送昆明硕阳生物公司全基因合成，上下分别游引入Hind III、Xba I酶切位点，以小写字母表示，命名该启动子为prrnO1O2；b、用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2引物对从新合成的基因序列上扩增prrnO1O2,使用Trans Fast Fly DNA聚合酶进行PCR扩增；PCR扩增体系含ddH₂O 14μL，5×PCR缓冲液(Mg²⁺)5μL，2.5mmol L^–1dNTPs 2.5μL，引物各1μL，DNA聚合酶0.5μL，稀释模板DNA 1μL；PCR扩增参数为95℃2min，95℃20s，54℃30s，72℃30s；35个循环；将回收目的片段分别连接到pEASY‑Blunt simple克隆载体，并转化至大肠杆菌感受态细胞Trans T1,经过常规纯化培养和蓝白斑筛选、PCR鉴定，取阳性克隆进行鉴定并测序；将该菌株进行扩大培养，并进行质粒纯化回收；c、将带有启动子片段prrnO1O2的载体与Bio3‑GFP载体均使用Hind III/Xba I双酶切，酶切反应体系为30μL，包括ddH₂O 12μL，10×M buffer 3μL，Hind III 1.5μL，Xba I 1.5μL，质粒12μL；37℃反应3h，凝胶电泳观察后回收目的片段后，用T4连接酶连接，连接反应体系为10μL：包括ddH₂O 1μL，T4ligation buffer 1μL，T4ligation0.5μL，目的片段5.5μL，载体片段2μL；检测新合成的prrnO1O2启动子是否具有启动子活性；在60μg/mL的Amp培养基上能够正常生长且菌体呈现出绿色，表明该启动子能够在细菌中启动下游GFP基因的表达；d、用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4引物对从原有载体上扩增得到的TetR基因序列连接到pEasy‑Blunt克隆载体上，PCR检测正确后，同时将该载体与Bio3‑GFP用Sal I/Kpn I双酶切，回收目的条带，用T4连接酶连接，PCR及酶切检测表达载体的正确性，命名为Bio3‑prrn‑TetR，在60μg/mL的Amp抗生素的培养基上，同时设置四环素浓度梯度，分别0、1、2.5、5、10、15、20μg/mL，结果显示在四环素的浓度为5μg/mL是菌体正常生长，而10μg/mL时细菌没有生长，说明四环素的使用最高浓度为5μg/mL；e、用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO5引物对用于扩增prrn+TetR+psbA表达盒，构建四环素诱导下的GFP基因的表达载体，连接到pEasy‑Blunt克隆载体上，PCR检测正确后，同时将该载体与Bio3‑prrn‑TetR均使用Hind III单酶切，回收目的条带，用T4连接酶连接，检测正确后，命名为Bio3‑TetR‑pO1O2‑GFP；在60μg/mL的Amp培养基上，含有该表达质粒的大肠杆菌能够正常生长，但是GFP基因没有表达出绿色荧光蛋白，说明TetR蛋白表达后结合到prrnO1O2启动子的核心操纵区上，抑制了prrnO1O2启动子的功能；而后加入5μg/mL的盐酸四环素，GFP蛋白表达，显示出绿色的菌体，但表达量降低；f、结果判定带有核心操纵子的prrnO1O2启动子在原核细胞中能够启动下游GFP基因的表达；TetR蛋白表达后结合到prrnO1O2启动子的核心操纵区上，抑制了prrnO1O2启动子；而加入5μg/mL的盐酸四环素后，下游GFP蛋白表达；说明这是一种基于四环素调控系统检测叶绿体启动子活性的方法。