[发明专利]一种通过连续克隆获得经基因修饰过的克隆猪的方法

摘要

本发明涉及一种通过连续克隆获得经基因修饰的克隆猪的方法，属于动物繁殖生物学领域。本发明以已获得的基因修饰猪的组织成纤维细胞为供体，利用体细胞核移植技术把供体细胞导入到去核的猪卵母细胞内构建基因修饰猪重构胚，然后进行电融合和电激活，并在猪胚胎体外培养液中培养3h后移植到发情的代孕母猪输卵管膨大部内，待代孕母猪妊娠约114d后分娩获得批量的基因修饰猪个体。本发明可克服利用基因编辑技术获得的基因修饰个体过程中出现目的基因修饰个体效率低且目的基因修饰个体间差异大的难题，以能够高效批量地生产目的基因表达及表型稳定的基因修饰克隆猪个体。

主权项

一种通过连续克隆技术生产经基因修饰过的克隆猪的方法，其特征在于，通过连续克隆获得经基因修饰过的克隆猪按照以下操作步骤进行：第一步、基因修饰猪成纤维供体细胞的培养与细胞系的建立获取刚出生的基因修饰猪的组织，建立基因修饰猪成纤维细胞系并进行传代培养；第二步、卵母细胞的准备从屠宰场收集的母猪卵巢，保存于适温生理盐水中运送回实验室，挑取猪的卵母细胞并进行体外成熟培养；第三步、重构胚的构建卵母细胞经过体外成熟培养后，用0.1mg.mL^‑1的透明质酸钠去除卵母细胞外围的卵丘细胞，将排出第一极体的卵母细胞放入预处理液中处理0.5～1h后移入卵母细胞操作液中，用显微注射针将极体及其周围胞质一起去除，然后将经基因修饰的猪成纤维供体体细胞导入去核的卵母细胞的卵间隙中，移出注射针，并轻轻按压供体细胞上方的透明带，使供体细胞与卵母细胞膜紧贴，获得重构胚；第四步、重构胚的电融合、电激活及体外培养1)重构胚的电融合和电激活将重构胚移入融合液中清洗三遍，进行重构胚的电融合处理，完成后移入NCSU23培养基中培养2h，再把待孤雌激活的卵母细胞在激活液中清洗三遍，然后再进行电激活，完成后重构胚移入CB培养液中后放入含有5％CO₂、5％O₂、38.5℃的三气培养箱中平衡2h；2)重构胚的体外培养将已平衡好的重构胚胎移入到PZM3培养液中，置于三气培养箱中培养至胚胎移植；第五步、胚胎移植及基因修饰克隆猪的获取选取自然发情的母猪作为胚胎移植的代孕母猪，将经过电融合和电激活培养后的重构胚用胚胎移植管移植到即将排卵或已排卵的两侧输卵管膨大部位后进行发育，妊娠114d后代孕母猪分娩获得基因修饰的克隆猪。