[发明专利]一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法

摘要

一种鱼类卵母细胞总RNA的提取方法，属于分子生物学领域，所述方法利用化学法和超声波破碎物理学方法相结合获得卵母细胞中含有的总RNA，并保证RNA完整性，可以用于下一步基因克隆、mRNA表达和高通量测序等研究。本发明在微量卵母细胞中加入1ml RNAiso Plus，可有效去除卵母细胞中核糖体等成分；分别在加入氯仿和异丙醇后，离心时间均延长了5min，有利于去除蛋白质等，并提高所获的RNA纯度与质量。

主权项

半滑舌鳎卵母细胞总RNA提取方法，其特征在于它的具体步骤如下：1)半滑舌鳎卵母细胞样品超声波破碎①取于‑80℃保存在无RNA酶1.5mL EP管中的半滑舌鳎成熟卵母细胞30粒，迅速将EP管安放于用液氮预冷的EP管盒中，加入1ml RNAiso Plus；②超声波处理器用之前将变幅杆及超声破碎头用焦碳酸二乙酯水溶液浸泡24h，然后高压灭菌，消除RNA酶污染；③将盛有半滑舌鳎成熟卵母细胞的无RNA酶EP管转移至冰水混合的EP管盒中，超声波处理器变幅杆浸入RNAiso Plus深度为1.0cm，探头要居中，不要贴壁；④连接电源，设定处理器超声模式，Pattern键是选择超声波模式键，按Pattern键设定4s超声和4s间隔，超声五次；然后设定1s超声和1s间隔，超声十次；总用时为60秒；确保门关闭后，ON启动超声操作，用完后，OFF关闭仪器；⑤将匀浆化样品移到新无RNA酶EP管，室温静置10min，以12000g转速4℃离心5min，吸取上清液700ul，移入新的无RNA酶EP管中，切勿吸取沉淀；2)总RNA的提取①在上述离心管中加入RNAiso Plus1/5体积的氯仿，样品剧烈振荡20s，溶液无分相现象后，再室温静置10min，以12000g转速4℃离心20min；从离心机取出离心管，此时样品分为三层，即无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层有机相；吸取上清液，转移至另一新的无RNA酶EP管中；切勿吸入中间蛋白层；②加入等体积预冷的异丙醇，使用涡旋混匀器充分混匀，室温静置15min；以12000g转速4℃离心15min，管底出现沉淀；3)RNA沉淀清洗小心弃去上清，缓慢地沿EP管壁加入1ml75％的乙醇，轻轻上下颠倒洗涤EP管的管壁，以12,000g转速，4℃离心10min后除净乙醇；4)RNA溶解与检测室温干燥沉淀2‑5min，加入20ul的RNase‑free水溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后、放于‑80℃保存。