[发明专利]以幼种苗作为外植体供体的黑果枸杞离体快速繁殖方法

摘要

本发明属于林木生物技术领域，具体涉及以幼种苗作为外植体供体的黑果枸杞离体快速方法，本发明通过无菌种苗的获得、外植体接种、继代增殖及炼苗移栽等完成。以种苗叶片为外植体，接种1个月时，外植体芽形成率为87.5%。以茎段为外植体，接种一个月时的芽形成率为100%。饥饿干燥处理完接种1个月后统计，玻璃化解除率为85.3%。该方法的再生效率极高。随繁殖次数的增加，再生效率呈指数级增加。生根率和移栽成活率均达80%以上。本发明以成熟种子作为最初实验材料，保存方便，不受季节限制。结合解除玻璃化的方法，非常适合稀缺黑果枸杞资源的保护和开发利用。繁殖个体的成本极低，适合黑果枸杞的工厂化育苗。

主权项

黑果枸杞离体快速繁殖方法，其特征是具体步骤如下：1) 无菌种苗的获得将黑果枸杞成熟种子置于35～37℃温水中处理7～24h或者不处理，在无菌超净工作台用70‑75%体积比的酒精浸泡种子30S～1min，再用0.1～0.2%质量体积比的氯化汞水溶液或者2%质量体积比次氯酸钠溶液浸泡2～5分钟，无菌水冲洗3～6遍，将种子接种到不添加任何植物生长调节剂的1/2MS或MS固体培养基上，20～28℃每天8～16小时光照培养，此步和以下各步用到的MS固体培养基均添加0.43～0.7%质量体积比的固化剂琼脂，3～4%质量体积比的蔗糖,121℃高压灭菌15～20min之前用NaOH或KOH溶液将pH值调节到5.4～5.8,1/2MS固体培养基添加蔗糖浓度为MS固体培养基的一半；2) 外植体接种待步骤1萌发的种苗长到叶片数为10～20时，将生长良好的幼叶片横向剪或切为直径3～5mm的小块，单片叶剪为2～3块，接种到含6‑BA 0.05～1.0 mg/L+NAA 0～0.5 mg/L的MS固体培养基上，20～28℃下置于微弱散射光下培养1～4周，之后转到正常光照下培养，每天光照8～12 h，将有叶或去叶的茎剪切为0.5～2 cm的小段，下端朝下插入含6‑BA 0.05～1.0 mg/L+NAA 0～0.5 mg/L的MS固体培养基上，20～28℃下每天光照8～12 h，或用叶片或茎外植体产生的无菌完整植株或无菌无根植株的幼嫩叶片和茎段做为外植体；3）继代增殖外植体接种4周左右进行继代，将培养材料转接到相同的培养基上，叶外植体产生的高度达到1cm以上的芽切下诱导生根，有节茎段产生的高度2 cm以上的芽切下诱导生根，切完之后的材料继代到相同培养基置于相同的培养条件下继续增殖，继代间隔时间为4周；4）干燥饥饿法去除玻璃化随着离体培养时间的延长，部分材料会出现玻璃化现象，将玻璃化或部分玻璃化的丛生芽、不定芽、带芽愈伤组织或带芽外植体放入无菌且透气良好的空瓶中，20～25℃每天光照8～12小时，3～28天后玻璃化现象消失，将解除玻璃化的材料按步骤3）的方法进行继代培养；5）根的诱导不添加任何植物生长调节剂的MS或1/2MS培养基均能用于诱导生根，或添加较低浓度的生长激素用于生根，获得的无性小植株或无根植株的茎和叶或再按步骤2～5的方法进行2次繁殖；6）炼苗移栽生根完整小植株要进行壮苗培养，木质化之后进行移栽驯，移栽介质121℃高压灭菌30 min以上，采用环境条件逐渐过渡的方法进行移栽，控制湿度，并适量使用甲基托布津广谱杀菌剂。