[发明专利]用三重复合免疫捕获RT-PCR同步检测百合三种病毒的方法

摘要

本发明提供了一种免疫捕获三重RT‑PCR同步检测百合隐症病毒、斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的方法，其步骤包括在同一个PCR反应管中用LSV、LMoV和CMV的多克隆抗体特异性捕获LSV、LMoV和CMV粒子、利用LSV、LMoV和CMV的特异性引物进行三重反转录聚合酶链式反应RT‑PCR、琼脂糖凝胶电泳检测目的片段；该方法将ELISA和RT‑PCR结合，对现有的免疫捕获RT‑PCR进行了改进，实现了用免疫捕获RT‑PCR同步检测三种百合病毒LSV、LMoV和CMV，从而完善了免疫捕获RT‑PCR技术。

主权项

1.一种用三重复合免疫捕获RT‑PCR同步检测百合隐症病毒LSV、斑驳病毒LMoV和黄瓜花叶病毒CMV的方法，其特征在于，包括以下步骤：①引物设计根据LSV、LMoV和CMV的CP基因序列, 设计LSV、LMoV和CMV的特异性正向和反向引物，扩增LSV、LMoV和CMV目的片段的大小分别为198bp、395bp和248bp；其中LSV、LMoV和CMV的特异性正向和反向引物序列为：LSV‑F: 5’‑ TATGGGCTTCCA ATACAAC‑3’LSV‑R: 5’‑TATTCGGTTTCCAGGTTC ‑3’LMoV‑F : 5’‑ TGGCACCTCACCAAATGTA‑3’LMoV‑R: 5’‑ CATCATCTGCTGTATGCCTCT‑3’CMV‑F: 5’‑ CTTTGTAGGGAGTGAACGCTGTA ‑3’CMV‑R: 5’‑AGATGGCGGCAACGGATA ‑3’；②三重复合免疫捕获1）取100mg复合感染LSV+LMoV+CMV的组织，加1mL PBST研磨后将研磨液转入1.5mL灭菌离心管中，4000rpm离心2min，上清液即感病组织粗提液；2）用pH 9.6的碳酸盐缓冲液将LMoV、LSV和CMV多克隆抗体稀释后混合，使LMoV、LSV和CMV三种抗体的终浓度分别为1μg/mL、10μg/mL和50μg/mL，取200μL上述稀释的混合抗体加入PCR管，37℃孵育2h；3）弃去步骤2）中三种抗体的包被混合液，用PBST洗3次，每次3min; 加入200μL感病组织粗提液，37℃孵育3h；4）弃去步骤3）中的感病组织粗提液，用PBST洗3次，ddH₂O洗1次，短暂离心，吸去残液；③三重RT‑PCR1) 在包被过的PCR管中分别加入10 μmol/L的LSV、LMoV和CMV特异性反向引物LSV‑R、LMoV‑R和CMV‑R各2μL以及ddH₂O 6μL，混合后于70℃保温10min，之后迅速冰浴2 min；2）三重RT：向上述PCR管中分别加入5×M‑MLV buffer 4μL、10mmol/L 的dNTP混合物2μL、30U/μL的RNase抑制剂0.68μL、200U /μL 的M‑MLV反转录酶0.70μL以及DEPC‑H₂O 0.62μL，混合均匀后，42℃水浴1h，70℃保温15 min，得到三种病毒的cDNAs混合物；3）三重PCR： 取一新的PCR管，分别加入上述步骤2）中三种病毒的cDNAs混合物2.0μL、10×PCR buffer 2.5μL、25 mmol/L 的MgCl₂ 2.5μL、2.5mmol/L 的dNTP混合物2.5μL、10μmol/L 的LSV特异性正向和反向引物LSV‑F 和LSV‑R 各0.5μL、10μmol/L 的LMoV特异性正向和反向引物LMoV‑F 和LMoV‑R 各0.5μL、10μmol/L 的CMV特异性正向和反向引物CMV‑F 和CMV‑R 各0.5μL、5U/μL的TaqDNA聚合酶 0.3μL以及ddH₂O 12.2μL，混合均匀后进行三重PCR；上述三重PCR的反应条件为: 94℃预变性4min，94℃变性30s，50℃～58℃退火45s，72℃延伸1min，扩增30～35个循环，最后72℃延伸7min，降至常温；④电泳检测三重PCR反应结束后取10μL反应产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳，在1×TBE缓冲液环境中，100V稳压电泳40min，然后用凝胶成像系统观察并记录结果，LSV、LMoV和CMV三种病毒核酸片段的电泳条带分别出现在198bp、395bp和248bp处；⑤结果分析根据电泳胶上扩增条带的有无及其大小判定所检测的样品是否感染LSV、LMoV或CMV，若凝胶中仅存在198bp的核酸片段则说明样品中含有LSV；若凝胶中仅存在395bp的核酸片段则说明样品中含有LMoV；若凝胶中仅存在248bp的核酸片段则说明样品中含有CMV；若凝胶中同时存在198bp和395bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV和LMoV；若凝胶中同时存在198bp和248bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV和CMV；若凝胶中同时存在198bp、395bp和248bp的核酸片段，则说明样品中同时含有LSV、LMoV和CMV。