[发明专利]一种乙醛‑DNA加合物的测定方法

摘要

一种乙醛‑DNA加合物的测定方法，即DNA中Ethylidene‑dG和Propano‑dG的测定方法，包括采用乙醛溶液暴露小牛胸腺DNA并加入精氨酸作为反应的催化剂，DNA溶液进行酶水解并依次加入稳定同位素内标、还原剂NaBH3CN和DNA水解酶。水解液经Strata‑X小柱固相萃取，收集洗脱液并引入LC‑MS/MS系统分析，可准确检测出Et‑dG和Propano‑dG的含量水平。本发明为全新的DNA中乙醛‑DNA加合物的测定方法，采用稳定同位素作为内标定量分析物可以减少样品前处理过程中引起的误差，串联质谱法更好的提高了方法的选择性、准确性和灵敏度。通过色谱柱以及洗脱条件的选择与优化，较好的提高了色谱分离过程，缩短了色谱分析的时间，减少了有机溶剂的消耗量。

主权项

一种乙醛‑DNA加合物的测定方法，所述乙醛‑DNA加合物是N2‑亚乙基‑鸟嘌呤（Ethylidene‑dG）、1,N2‑丙醇‑鸟嘌呤（Propano‑dG），其特征在于：包括以下具体步骤：a、乙醛暴露小牛胸腺DNA：取400 μg小牛胸腺DNA，加入配制好的乙醛溶液，对照组加入同等体积的PBS溶液，上述溶液中各加入8.0 mg的精氨酸，放入37℃恒温培养箱中24 h；使用2倍体积的冰乙醇沉淀DNA并终止反应，离心去掉上清液，用70%的乙醇水溶液清洗DNA样品，得到的DNA团块晾干并加入200 μL超纯水复溶，用NanoDrop 2000超微量分光光度计在260nm处检测DNA的含量，对于双链DNA一个吸收单位（OD）相当于50 μg/mL；b、DNA的酶水解及固相萃取（SPE）：将上述DNA溶于500 μL的10 mM Tris‑HCl/5 mM MgCl2缓冲液中，加入30 mg 的还原剂NaBH3CN，将N2‑亚乙基‑鸟嘌呤（Ethylidene‑dG）还原成N2‑乙基‑鸟嘌呤（Et‑dG）来检测，加入20 μL混合内标，加入60U脱氧核糖核酸酶Ⅰ，在37℃中孵育2h，随后加入0.008U磷酸二酯酶Ⅰ和30U碱性磷酸酶在37℃中继续孵育2h，水解液经1 mL甲醇活化和1 mL超纯水平衡的Strata‑X固相萃取小柱，用1 mL超纯水和1 mL 10%的甲醇水淋洗，最后用1 mL 50%的甲醇水洗脱，收集洗脱液即为样品待测液；c、标准工作液的配制：用甲醇配制不同浓度的N2‑乙基‑鸟嘌呤（Et‑dG）、1,N2‑丙醇‑鸟嘌呤（Propano‑dG）标准工作溶液；d、液相色谱‑串联质谱（LC‑MS/MS）测定，吸取配制好的不同浓度混合标准工作溶液，注入LC‑MS/MS系统，得到线性回归方程，对样品待测液进行测定，测得分析物与内标峰面积的比值，代入一元线性回归方程，求得样品待测液中分析物的含量；在LC‑MS/MS测定中，选取Thermo AcclaimTM Polar Advantage II C18 色谱柱，规格4.6×150 mm，3 μm，流动相体系选取甲醇A和纯水溶液B，等度洗脱条件为：0‑15 min：35% A；流速为0.40 mL/min，分析时间为15 min，进样量为5 μL；串联质谱检测器条件如下：电喷雾离子源（ESI），多反应监测正离子扫描方式；喷雾电压：5500 V，离子源温度：550℃，气帘气的量为20 psi，雾化气为70 psi， 干燥气为75 psi，碰撞气为9 psi，射入电压：10 V，碰撞能：9 eV，驻留时间：200 ms；监测离子对为Et‑dG：296.2→180.2定量离子对，296.2→117.2定性离子对；内标[15N5]Et‑dG为271.2→155.2；Propano‑dG：338.3→222.1定量离子对，338.3→117.2定性离子对；内标[15N5]Propano‑dG为343.2→227.2。