[发明专利]一种混合蛛丝蛋白纤维的制备方法

摘要

本发明涉及一种混合蛛丝蛋白纤维的制备方法，包括：以大腹园蛛次壶腹腺丝的全长编码基因和梨状腺丝完整重复区为模板，采用融合PCR技术进行拼接，并与pLX载体连接，构建重组质量，转入BL21中进行表达。使用变性纯化手段，最终获得混合蛛丝蛋白溶液，并冻干保存。本发明反应条件温和，成本低廉，工艺简单，易于操作；制备出的混合蛛丝蛋白纤维，具有良好的生物相容性，并且纤维粗细均匀，表面光滑，在生物医学等领域有着潜在的应用价值。

主权项

一种混合蛛丝蛋白纤维的制备方法，包括：(1)以大腹园蛛次壶腹腺丝MiSp的全长编码基因为模板，然后通过PCR扩增得到次壶腹腺丝MiSp的NT端基因片段MiSp‑NT与CT端基因片段MiSp‑CT，然后以梨状腺丝PySp完整重复区Rp的编码基因作为模板，通过PCR扩增获得一个完整重复区的基因片段PySp‑Rp；(2)将步骤(1)中三段基因片段MiSp‑NT、MiSp‑CT、PySp‑Rp通过PCR技术得到完整基因片段MiSpNT‑PySpRp‑MiSpCT；(3)将上述完整基因片段MiSpNT‑PySpRp‑MiSpCT、pLX质粒分别进行双酶切，然后进行纯化回收后混合，再加入T4连接酶反应，得到连接产物；(4)将上述连接产物转入DH5α感受态细胞中进行转化，37℃过夜培养后，挑取单克隆进行双酶切检查，将酶切正确的重组质粒pLX‑MiSpNT‑PySpRp‑MiSpCT，转入BL21感受态细胞中，37℃过夜培养后，挑取重组质粒单克隆接入LB培养基中，37℃过夜培养后，再转接入LB培养基中培养，然后加入IPTG诱导培养，收集菌体；(5)将上述菌体重悬于裂解缓冲液Lysis Buffer中，高压破菌后，离心，收集沉淀，纯化、冻干，得到蛋白粉末；(6)将上述蛋白粉末加入六氟异丙醇溶解后，得到溶液，然后用针头吸取溶液注入75％的甲醇中，即得混合蛛丝蛋白纤维；其中蛋白粉末和六氟异丙醇的比例关系为100mg：1mL。