[发明专利]一种基于IgE线性表位多克隆抗体定量检测过敏原β-乳球蛋白及其致敏性残基的方法

摘要

一种基于IgE线性表位多克隆抗体定量检测过敏原β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法，通过重组表达技术制备β‑乳球蛋白IgE表位串联体蛋白，再分别以串联体蛋白及β‑乳球蛋白为抗原，按常规技术制备相应多克隆抗体，再经亲和纯化制备特异性抗体。以β‑乳球蛋白多克隆抗体为捕获抗体，生物素化串联体多克隆抗体为检测抗体建立夹心ELISA法，经酶标仪检测吸光值，通过建立标准曲线，实现对食品中过敏原β‑乳球蛋白及其致敏性残基的定量检测。本发明建立的方法具有操作简单、灵敏度高、特异性好等优点，为高通量分析检测多种食品中相关过敏原及其致敏性残基提供了一种有效的方法，具有良好的推广和应用前景。

主权项

一种基于IgE线性表位多克隆抗体定量检测过敏原β‑乳球蛋白及其致敏性残基的方法，其特征是按以下步骤：（1）以牛乳β‑乳球蛋白为抗原，通过常规方法获得β‑乳球蛋白多克隆抗体；（2）CNBr‑Sepharose 4B柱材与β‑乳球蛋白偶联，制备免疫亲和柱；抗血清与等体积的PBS混合，将血清缓慢加入Sepharose 4B亲和柱中，室温下孵育30 min，再循环上样一次；用20倍柱体积的PBS进行非特异性洗脱，再用10倍柱体积的3 M MgCl₂进行特异性洗脱得到β‑乳球蛋白特异性多克隆抗体；纯化后，用截留分子量为3 kDa的超滤管对抗体进行除盐，并浓缩至合适的体积；（3）以β‑乳球蛋白肽段AA1~8、AA31~48、AA47~60、AA67~78、AA75~86、AA127~144和AA141~152为B细胞表位，并依次编号B1、B2、B3、B4、B5、B6和B7，以β‑乳球蛋白肽段AA77~97为T细胞表位，T细胞表位位于串联体N端，B细胞表位位于串联体C端，用两个赖氨酸连接T细胞表位与B细胞表位，用一个甘氨酸连接相邻的两个B细胞表位；通过DNAStar软件对不同组合串联体的抗原性、表面可及性及亲水性进行分析，使每个表位的抗原性和亲水性大于0，同时表面可及性大于1；再利用网络服务器SOMPA对不同组合的串联体二级结构进行分析，使表位形成β转角和无规则卷曲结构；通过以上生物信息学方法对表位串联体的分析，最终得到的串联体组合为：T‑K‑K‑B1‑G‑B6‑G‑B5‑G‑B3‑G‑B7‑G‑B2‑G‑B4；再合成串联体基因，并通过原核表达制备β‑乳球蛋白表位串联体重组蛋白；最后，以串联体蛋白为抗原，通过常规方法获得β‑乳球蛋白IgE线性表位串联体蛋白多克隆抗体；（4）按步骤（2）对β‑乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体进行纯化；再把纯化得到的β‑乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体与长链生物素按1：20的摩尔比混合，冰浴2 h，接着用脱盐柱除去多余的生物素；（5）在表位肽两端各加入一个氨基酸作为阻断肽，合成这7个表位肽及其阻断肽，采用间接竞争ELISA法分析β‑乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体对表位肽及阻断肽的识别能力；将β‑乳球蛋白标准品用碳酸盐缓冲液稀释后，100 μL/孔加入板A，4 °C包被过夜，PBST洗三次，每次3 min扣干；另取一块酶标板B，板A与板B中每孔加入250 μL的3%明胶溶液37 °C封阻；板B封阻1 h后清洗，每孔加入β‑乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体和浓度梯度的多肽各60 μL，PBS为对照，37 °C孵育1 h；板A用PBST清洗3次，从板B中取100 μL抗体与多肽的反应液加入到板A中，37 °C孵育1 h后清洗，每孔加入100 μL OPD显色液，37 °C避光孵育15 min后，每孔加入50 μL 2 M的H₂SO₄终止反应，然后立即用酶标仪测吸光值；根据吸光值计算不同浓度肽的抑制率，根据抑制率高低可以反映串联体多克隆抗体对不同表位肽和阻断肽识别能力的强弱；（6）以β‑乳球蛋白多克隆抗体为捕获抗体，生物素化β‑乳球蛋白IgE线性表位串联体多克隆抗体为检测抗体，β‑乳球蛋白为检测抗原，采用棋盘法确定捕获抗体和检测抗体最佳工作浓度；酶标板每孔加入100 μL碳酸盐稀释的捕获抗体，4 °C包被过夜，PBST洗三次，每次3 min扣干，每孔加入250 μL 的4%明胶溶液37 °C封阻1.5 h；清洗后，每孔加入100 μL已知浓度梯度的β‑乳球蛋白，37 °C孵育1.5 h；清洗后，每孔加入100 μL检测抗体，37 °C孵育0.5 h；清洗后，每孔加入100 μL辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素，37 °C孵育1 h；清洗后，每孔加入100 μL OPD溶液，37 °C避光孵育20 min后，每孔加入50 μL 2 M的H₂SO₄终止反应，然后用酶标仪测吸光值，根据吸光值和抗原浓度的关系绘制β‑乳球蛋白标准曲线；（7）液态乳制品：取一定量的液态乳制品于离心管中，用低温离心机10,000g，4 °C离心15 min，去除脂肪层和沉淀，取样用封阻液稀释至检测线性范围内作为待检样品;粉状乳制品：称一定量的样品用PBS稀释，溶解后离心，去除沉淀和脂肪，上清用封阻液稀释至检测线性范围内作为待检样品；（8）将所需检测的食品进行预处理，制备检测样，根据上述方法包被捕获抗体、封闭清洗后，每孔加入预处理的样品，孵育清洗后，按步骤（6）依次加入检测抗体、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素、OPD溶液，经H₂SO₄终止反应后，用酶标仪检测吸光值，把吸光值带入标准曲线计算出被检样品中β‑乳球蛋白及其致敏性残基的含量。