[发明专利]一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法

摘要

一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法，本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及一种细菌介导侵染转化蒙古柳的方法。本发明的目的是为了解决现有技术中没有蒙古柳的遗传转化受体再生体系的建立方法，而提供了一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法。本发明利用农杆菌介导侵染转化外植体为叶片诱导的愈伤组织，共培养和筛选转化愈伤组织，并诱导分化抗性丛生芽，在生根培养培养基上再生成植株，GUS染色检测转化再生植株表明有35S启动下β‑半乳糖苷酶活性。证明通过本发明的方法实现了农杆菌介导侵染转化蒙古柳。本发明的农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法用于植物基因工程领域。

主权项

1.一种农杆菌介导侵染转化蒙古柳的方法，其特征在于：该转化方法按以下步骤进行：一、人工培育蒙古柳无菌苗的叶片愈伤组织的诱导：蒙古柳种子用体积分数为69％～71％的酒精和体积分数为2％～4％的次氯酸钠消毒、灭菌后，在1/2MS培养基上发芽后，生长到4叶期或5叶期的无菌苗，剪取无菌苗长×宽为(0.5cm±0.1cm)×(0.5cm±0.1cm)的叶片在MSYD1培养基上诱导愈伤组织；于27.5℃～28.5℃，先光照条件下培养14h，再暗条件下培养10h，这样光暗条件交替培养20～25天，然后更换一次培养基，60～65天诱导出愈伤组织；二、农杆菌侵染转化和共培养：挑取含PBI121质粒的农杆菌，单克隆培养于含有50mg/L±2mg/L卡那霉素和100mg/L±2mg/L利福平的YEP液体培养基中；在27.5℃～28.5℃条件下，以200rpm培养，至农杆菌菌株浓度OD600值为0.5～0.8时，继续向培养液中加入50μL±1μL浓度为100mmol/L±5mmol/L的乙酰丁香酮培养1～2小时；将培养液转入无菌的离心管中，常温下，4500rpm，离心15min～20min收集农杆菌；以液体MS培养基重新悬浮农杆菌，调节农杆菌菌株浓度OD600值为0.5～0.8时；无菌操作台中，用镊子将步骤一诱导出的愈伤组织夹成直径为3mm～5mm的块状，加入悬浮好的农杆菌菌液10～20mL，同时加入20μL±1μL浓度为100mmol/L的乙酰丁香酮，在侵染5min～15min后，常温下，以50rpm摇床培养5min～10min；弃去全部农杆菌菌液，用无菌滤纸吸去愈伤组织表面残留的菌液，然后将愈伤组织转入铺有用MS培养基充分浸透过的无菌滤纸的愈伤组织筛选培养基MSYD1上，在24℃～26℃条件，全天黑暗培养2‑3天，得到共培养的愈伤组织；三、脱菌与抗性丛生芽的分化：将步骤二共培养的愈伤组织放到无菌蒸馏水中洗去表面的菌，然后加入浓度为1000mg/L±10mg/L的羧苄青霉素的溶液中振荡洗菌20min～30min，再用无菌蒸馏水洗2～3次，放在灭菌滤纸上吸干，接种到筛选愈伤诱导培养基MSYD2，在24℃～26℃下，先光照条件下培养10h，再暗条件下培养14h，这样光暗条件交替培养21天～22天；将抗性愈伤组织转接到筛选分化培养基MSFH3上，至OD600值为0.5～0.8时，在24℃～26℃条件，先光照条件下培养10h，再暗条件下培养14h，这样光暗条件交替培养20～25天，继代培养1次～3次，直到分化出抗性丛生芽；四、抗性丛生芽生根培养获得抗性转化子：取步骤三分化出抗性丛生芽中的单个芽接种到生根培养基上MSSG4，在24℃～26℃条件，先光照条件下培养10h，再暗条件下培养14h，这样光暗条件交替培养20天～22天长出主根；进一步接种到壮苗培养基MSSG5，在22℃～24℃条件下，先光照条件下培养8h，再暗条件下培养16h，这样光暗条件交替培养20～25天，得到转化植株；通风炼苗后，移栽至温室花盆中培养成一年生苗，即获得了抗性转化子；其中MSYD1培养基由MS干粉培养基4.73g/L、蔗糖30g/L、2,4‑D 3mg/L、6－苄基氨基嘌呤0.5mg/L、萘乙酸0.2mg/L、琼脂粉8g/L和蒸馏水组成，pH＝5.8±0.2；MSYD2培养基由MS干粉培养基4.73g/L、蔗糖30g/L、2,4‑D 3mg/L、6－苄基氨基嘌呤0.5mg/L、萘乙酸0.2mg/L、羧苄青霉素500mg/L、卡那霉素50mg/L、琼脂粉8g/L和蒸馏水组成，pH＝5.8±0.2；MSSG4培养基由MS干粉培养基2.4g/L、蔗糖25g/L、引哚乙酸0.5mg/L、琼脂粉8g/L和蒸馏水组成，pH＝5.8±0.2；MSSG5培养基由MS干粉培养基2.4g/L、蔗糖20g/L、琼脂粉8g/L和蒸馏水组成，pH＝5.8±0.2；MSFH3培养基由MS干粉培养基4.73g/L、蔗糖30g/L、6‑苄基氨基嘌呤0.5mg/L、萘乙酸0.02mg/L、羧苄青霉素500mg/L、卡那霉素50mg/L、琼脂粉8g/L和蒸馏水组成，pH＝5.8±0.2。