[发明专利]一种基于壳聚糖-石墨烯/金纳米颗粒复合膜的电化学DNA传感器的制备及应用的方法

摘要

本发明公开了一种利用金纳米颗粒(AuNPs)和壳聚糖(CTS)‑石墨烯(GR)复合膜修饰的离子液体碳糊电极(CILE)，以此为平台构建了一种新型电化学DNA传感器，并将其应用于金黄色葡萄球菌特征基因序列的测定。将离子液体1‑己基吡啶六氟磷酸盐与石墨粉以一定的比例混合制得CILE，探针ssDNA序列通过静电吸附固定在CTS‑GR/AuNPs/CILE上后与目标ssDNA序列杂交，以亚甲基蓝为指示剂来检测与目标序列的杂交反应。实验结果表明复合材料具有大的比表面积和良好的导电性，能够增加ssDNA探针的负载量，从而有效地提高电化学响应信号。

主权项

1.一种基于壳聚糖‑石墨烯/金纳米颗粒复合修饰电极的电化学DNA传感器在金黄色葡萄球菌特征序列检测方面的应用，其特征在于所述电化学DNA传感器的制备方法包括如下步骤：(1)石墨粉与离子液体正己基吡啶六氟磷酸盐以一定比例混合研磨均匀得到离子液体修饰碳糊，然后将离子液体修饰碳糊填入玻璃电极管中压实，内插铜线作为导线，可得到离子液体修饰碳糊电极(CILE)；(2)将氯金酸和硝酸钠溶液以一定比例混合制备电解液，CILE为工作电极，铂片为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，利用恒电位沉积法在CILE表面得到金纳米颗粒，用蒸馏水清洗后得到AuNPs/CILE，真空干燥后备用；(3)将8.0μL CTS‑GR复合材料的分散液涂于AuNPs/CILE表面，晾干后得到修饰电极CTS‑GR/AuNPs/CILE；(4)在CTS‑GR/AuNPs/CILE电极表面均匀滴涂含有探针ssDNA序列的缓冲溶液，自然晾干后分别使用0.5％十二烷基磺酸钠(SDS)溶液和二次蒸馏水冲洗3次，以除去未吸附的探针ssDNA序列，即可得到固定有探针序列的电极ssDNA/CTS‑GR/AuNPs/CILE；步骤(1)所述玻璃电极管内径为3mm～5mm，两端用砂纸80#～1200#打磨光滑，所述研磨的时间为1.5h～3h，石墨粉与离子液体正己基吡啶六氟磷酸盐的质量比为2：1；步骤(2)中氯金酸的浓度为3.0mmol/L，硝酸钠的浓度为0.1mol/L，恒电位沉积法的沉积电位为‑0.2V(vs.SCE)，沉积时间为30s；步骤(3)中CTS‑GR复合材料的分散液由1.0mg GR超声分散在1.0mL壳聚糖中得到；步骤(4)中在电极表面滴涂含有1.0×10‑6mol/L的探针ssDNA序列的PBS缓冲溶液，PBS缓冲溶液的浓度为50.0mmol/L，pH为7.0，滴涂量为10.0μL；所述探针ssDNA的序列是5'‑TGG ACG TGG CTTAGC GTATAT T‑3'；所述应用包括以下步骤：(1)将不同修饰电极浸入亚甲基蓝(MB)溶液中吸附一定时间，取出后依次用0.5％SDS溶液和二次蒸馏水充分洗涤，以除去表面吸附的MB，使用示差脉冲伏安法(DPV)研究MB在不同修饰电极上的电化学行为；所述不同修饰电极分别为ssDNA/CTS/CILE，ssDNA/CTS/AuNPs/CILE，ssDNA/CTS‑GR/CILE，ssDNA/CTS‑GR/AuNPs/CILE，dsDNA/CTS‑GR/AuNPs/CILE；(2)将含有不同浓度的目标序列的PBS缓冲溶液直接滴涂在ssDNA/CTS‑GR/AuNPs/CILE表面，杂交后分别用0.5％的SDS溶液和二次蒸馏水冲洗，以除去未杂交的目标序列，将杂交后的电极浸入MB溶液中吸附一定时间，取出后依次用0.5％SDS溶液和二次蒸馏水充分洗涤，使用示差脉冲伏安法(DPV)测定还原峰电流变化，得到互补ssDNA浓度与电流值变化大小的标准工作曲线，以研究电化学DNA传感器的灵敏度；所述目标序列的不同浓度为0，1.0×10‑13，1.0×10‑12，1.0×10‑11，1.0×10‑10，1.0×10‑9，1.0×10‑8，1.0×10‑7和1.0×10‑6mol/L；(3)将ssDNA/CTS‑GR/AuNPs/CILE与不同的ssDNA序列杂交，将杂交后的电极浸入MB溶液中吸附一定时间，取出后依次用0.5％SDS溶液和二次蒸馏水充分洗涤，使用示差脉冲伏安法(DPV)测定并记录MB的响应电流来研究所构建的DNA传感器的选择性；所述不同的ssDNA序列分别为非互补ssDNA序列、三碱基错配ssDNA序列、单碱基错配ssDNA序列和互补目标ssDNA序列；互补目标ssDNA序列：5'‑AATATA CGC TAA GCCACG TCCA‑3'；单碱基错配ssDNA序列：5'‑AAGATACGC TAA GCCACG TCC A‑3'；三碱基错配ssDNA序列：5'‑AAGATACGC TAC GCCACG TCTA‑3'；非互补ssDNA序列：5'‑GCG GTT GAATCG GCGATG GGT G‑3'。