[发明专利]一种体外人工分离淋巴细胞及冷冻保存的方法

摘要

本发明公开了一种体外人工分离淋巴细胞及冷冻保存的方法，包括：抽取静脉血注入采血管，3000rpm离心10分钟；取上层淡黄色血浆作为自体血浆，采血管加特定培养液；第一离心管加Ficoll-Paque Plus，将稀释血样加在其上,400g离心30分钟；第二吸管吸取第一离心管中不透明细胞层转第二离心管；第二离心管加冷特定培养液，250g离心10分钟；弃上清，重悬淋巴细胞于冷特定培养液，洗涤两次，留细胞悬液；将第二离心管中淋巴细胞重悬于冷冻保存液；将淋巴细胞转冻存管，4℃平衡10分钟，按1℃/分钟降温，将细胞存在-150℃气态液氮罐。本发明改良并建立一种能长期冻存在深低温下高活性淋巴细胞体外生产流程，可获得足量高活性淋巴细胞，通过预存淋巴细胞，可择机复苏、培养、回输淋巴细胞。

主权项

一种体外人工分离淋巴细胞及冷冻保存的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、对淋巴细胞进行分离：抽取10ml静脉血注入EDTA抗凝真空采血管，待血液与抗凝剂混合均匀后，在3000rpm和室温下离心10分钟；用第一塑料巴氏吸管吸取血样中上层淡黄色血浆作为自体血浆，然后在EDTA抗凝真空采血管中加入1:1的特定培养液稀释血样；取15ml的第一锥形离心管加入5mlFicoll‑Paque Plus溶液，再将稀释后的血样加在Ficoll‑Paque Plus溶液上面,在400g加速度和室温下离心30分钟；用第二塑料巴氏吸管吸取第一锥形离心管中两层液体间的不透明细胞层，获得淋巴细胞，转入第二锥形离心管；在第二锥形离心管中加入4℃预冷的特定培养液，与淋巴细胞充分混合，250g加速度下离心10分钟；弃上清，重悬第二锥形离心管中的淋巴细胞于4℃预冷的特定培养液中，重复洗涤两次，留取细胞悬液获得纯化的淋巴细胞；A2、对纯化的淋巴细胞进行冷冻保存：将第二锥形离心管中纯化的淋巴细胞重悬于3ml含10％DMSO和30％自体血浆的冷冻保存液中；将淋巴细胞转入冻存管中，4℃平衡10分钟，然后按照1℃/分钟的降温速度进行降温，最后保存在‑150℃的气态液氮罐中。