[发明专利]一种用于高通量测序检测的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的构建方法及其应用

摘要

本发明公开了一种用于高通量测序检测的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的构建方法，其特征在于覆盖人类BRCA1/2基因全部外显子区域突变。本发明的构建方法针对BRCA1和BRCA2基因全外显子序列进行单管，快速完成文库的构建，整个文库构建过程仅需要2～3小时，手动时间仅仅需要15～30分钟即可，结合高通量测序平台可以十分有效的解决目前对于临床上肿瘤疾病中在少量的临床样本基础上需要对基因全外显子检测这一难点，且成本低廉。

主权项

一种用于高通量测序检测的肿瘤BRCA1/2基因变异文库的构建方法，其特征在于：覆盖人类BRCA1/2基因全部外显子区域突变，具体包括如下步骤：(1)针对目的基因BRCA1/2设计第一基本扩增引物组和第二基本扩增引物组，该第一基本扩增引物组和第二基本扩增引物组的所有正向引物和反向引物的5’端均设有额外的2～5个T，且该2～5个T的靠近3’端的第一个T具有PNA修饰，同时该第一基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃，该第二基本扩增引物组的Tm值相差不超过1℃；(2)设计一不对称连接探针组与一不与人类基因组形成互补的通用引物，不对称连接探针组含有多对不同的不对称连接探针，每对不对称连接探针均包括可自身形成环状的一正向探针和一反向探针，该正向探针和反向探针从3’端至5’端均依次包括一能够与不对称连接探针的5’端若干连续碱基配对的互补序列、一与所述通用引物互补配对的扩增序列和一与上述2～5个T相对应的粘性末端识别序列，同时各正向探针和反向探针均具有相应的标签序列，上述每对不对称连接探针的正向探针和反向探针的Tm值相差不超过1℃；(3)将模板、上述第一基本扩增引物组置于一含有RingCap‑Taq酶的第一PCR反应体系中进行扩增，纯化后得第一扩增产物；将模板、上述第二基本扩增引物组置于一含有RingCap‑Taq酶的第二PCR反应体系中进行扩增，纯化后得第二扩增引物；(4)将第一扩增产物、第二扩增产物、不对称连接探针组、通用引物和上述RingCap‑Taq酶混合进行PCR，纯化后获得所述用于高通量测序的肿瘤BRCA1/2基因变异文库；上述RingCap‑Taq酶由Taq酶、DNA连接酶和DNA末端修饰酶组成。