[发明专利]以TNS-MWCNT复合材料为抗体和示踪标记物载体的电化学免疫传感器构建方法

摘要

本发明公开了一种以TiO₂纳米片(TNS)‑多壁碳纳米管(MWCNT)复合材料为抗体和示踪标记物载体的电化学免疫传感器构建方法，首先通过水热法制备出TNS‑MWCNT复合材料并氨基化，然后将其分散于Nafion溶液中并滴加在电极表面。以氨基交联剂BS³为双氨基交联剂将捕获抗体（Ab1）共价结合在NH₂‑TNS‑MWCNT表面，用于三明治型夹心测定。同时，BS³还被用于将辣根过氧化物酶（HRP）和信号抗体（Ab2）固定在NH₂‑TNS‑MWCNT表面以制备示踪标记物。采用本发明方法制备所得的电化学免疫传感器能够快速地测定α‑甲胎蛋白，且灵敏度较高、线性范围较大、检测限较低。

主权项

一种以TNS‑MWCNT复合材料为抗体和示踪标记物载体的电化学免疫传感器构建方法，其特征在于，包括如下步骤：①NH₂‑TNS‑MWCNT复合材料的制备：TNS‑MWCNT的制备：称取50 mg的MWCNTs分散在40 mL的异丙醇中超声20 min，随后加入50 μL二亚乙基三胺，搅拌均匀后，加入3.6 mL异丙醇钛，再次搅拌均匀后将混合液转移至反应釜中，于180－220℃反应18－28 h；反应结束后，取出，冷却至室温，黑色沉淀物经过离心分离、洗涤、干燥，即得到复合纳米材料TNS‑MWCNT；氨基化TNS‑MWCNT的制备：将120 mg TNS‑MWCNT与20 mL乙醇、1 mL 28%氨水和5 mL 3‑氨丙基三乙氧基硅烷混合后，机械搅拌12h，离心分离，弃去上清液，所得固体残留物洗涤、干燥后，室温下储存备用，记为NH₂‑TNS‑MWCNT；②示踪标记物的制备：HRP︱NH₂‑TNS‑MWCNT︱Ab2示踪标记物的制备：将2 mg BS³溶解在0.5 mL 0.02 M 的PBS缓冲液中获得溶液A，然后将3 mg NH₂‑TNS‑MWCNT分散于溶液A中，搅拌下加入400 μL 2.5 mg·mL^‑1的辣根过氧化物酶水溶液并在室温下孵育30 min，然后加入20 μL 含1.0 mg·mL^‑1信号抗体Ab2的PBS缓冲液，4℃下搅拌4 h，离心分离，所得沉淀物用洗涤缓冲液洗涤并用封闭缓冲液在室温下封闭30 min，最后用洗涤缓冲液洗涤后，分散于含0.1% 牛血清蛋白的1.0 mL PBS缓冲液中，备用，记为HRP︱NH₂‑TNS‑MWCNT︱Ab2；③免疫传感器的构建：将6 mg 步骤①所得NH₂‑TNS‑MWCNT分散于1 mL 含1% Nafion溶液中，超声20 min以得到均匀的分散液，取5 μL分散液滴加在预处理好的玻碳电极表面，室温下自然晾干；然后在玻碳电极表面滴加10 μL 含2 mg·mL^‑1 BS³的PBS缓冲液并在室温下孵育1 h，随后滴加5 μL 0.5 mg·mL^‑1 的捕获抗体Ab1，室温下孵育60 min，浸入PBS缓冲液中洗涤3 min，然后将该玻碳电极用5 μL封闭缓冲液孵育30 min，再分别用洗涤缓冲液和PBS缓冲液洗涤3 min，即得电化学免疫传感器。