[发明专利]一种对虾胚胎细胞的分离与培养方法

摘要

本发明建立一种有效的对虾胚胎细胞解离与培养技术，并将其应用于对虾胚胎细胞建系研究。本发明优化了对虾胚胎的无菌消毒处理技术，可直接从对虾育苗厂收集虾卵，运回实验室后处理，尤其是碘伏的处理浓度的优化，既保证有效控制微生物和原生动物的污染，又最大程度降低碘伏对胚胎的毒性；优化了对虾完全培养基的配方，为对虾胚胎细胞的贴壁和生长提供了更合适的营养条件，贴壁更快，生长更好，同时简化了培养基的配方，降低了培养基的成本；采用由适当孔径不锈钢滤网制作的胚胎细胞收集器，捣碎对虾胚胎的方法，可在短时间内获得大量活的胚胎细胞和细胞团，操作简便快速，仅用数秒，不易污染，效果远超已报道的其它解离方法。

主权项

1.一种对虾胚胎细胞的培养方法，其特征在于，所述的培养方法是将分离的对虾胚胎细胞悬液接种到培养瓶或培养板中，于28℃，3% CO2培养箱中静置培养；每2天更换一半体积的对虾完全培养基；所述的对虾胚胎细胞悬液，其制备方法如下：将清洗保存的对虾胚胎转移到已灭菌的研钵内，弃除多余培养基；用已灭菌的胚胎细胞收集器的弧形不锈钢滤网挤压对虾胚胎来捣碎受精膜，使胚胎细胞游离出来；然后取新鲜的对虾基础培养基，冲洗不锈钢滤网，收集所有胚胎细胞和细胞团，再用对虾基础培养基，沉降法洗涤1‑2次，至澄清透明，最后用对虾完全培养基悬浮胚胎细胞和细胞团获得对虾胚胎细胞悬液；所述的对虾基础培养基的制备方法如下：在1升超纯水中溶解20.55 g L‑15培养基、5 g NaCl、2 g葡萄糖、1 g NaHCO3、0.01 g牛磺酸、0.01 g脯氨酸、1.0×105 IU 青霉素钠和100mg硫酸链霉素，调节pH值至7.2‑7.4，用0.22 μm微孔滤膜过滤除菌，‑20℃保存；所述的对虾完全培养基的配制方法如下：每升上述对虾基础培养基中，添加8%胎牛血清、20μg碱性成纤维细胞生长因子和 20μg表皮生长因子，pH7.2‑7.4；用0.22 μm 微孔滤膜过滤除菌完成制备；所述的清洗保存的对虾胚胎，是用吸管收集对虾胚胎至离心管中，无菌海水洗涤5‑6次，再将胚胎转移到70目不锈钢滤网中，淘洗数次后，流水连续冲洗1‑2 h，然后用10%碘伏处理5‑10分钟，再用75%酒精漂洗20‑30秒去除碘伏；然后依次用添加有2000 IU/mL青霉素和链霉素的无菌海水和PBS漂洗去除酒精；最后暂存于对虾基础培养基中。