[发明专利]一种新的新城疫卵黄抗体代替血清抗体监测的方法

摘要

本发明属于卵黄抗体监测技术领域，具体涉及一种新的新城疫卵黄抗体代替血清抗体监测的方法。利用卵黄样品代替血清样品，利用水溶性处理液提取卵黄液和氯仿提取卵黄液进行抗体监测代替血清抗体监测，抗体监测过程中不需要采血，只需要收集禽蛋，不会对家禽产生应激，不会影响家禽的健康和生产性能；抗体监测过程中用两种卵黄处理液的混合液新城疫抗体效价经修订后代替血清抗体效价，主要用于蛋禽和种禽的新城疫抗体监测，也可用于评估雏禽疫病母源抗体水平以确定首免时间。

主权项

一种新的新城疫卵黄抗体代替血清抗体监测的方法，其特征在于，步骤如下：(1)卵黄原料采集步骤鸡蛋采集是在养禽场中随机采集鸡蛋20枚或以上，保证采集的鸡蛋来自整个鸡群的分散度；将禽蛋用镊子在壳上轻轻敲开直径1cm的小洞，撕开壳膜将蛋清完全倒出，再打开蛋壳将蛋黄完整倒入培养皿，进而挑开卵黄囊，用注射器直接避开表面蛋清抽取卵黄，将抽取到的卵黄注入到小烧杯中，玻棒搅匀使全部提取卵黄充分混匀，备用；(2)卵黄抗体提取A、水溶性处理液提取卵黄中抗体吸取2ml提取卵黄加入离心管中，再加入2ml水溶性处理液，充分振荡混匀，室温放置1h，得到浑浊的卵黄抗体提取液A，备用；B、氯仿提取卵黄中抗体吸取2ml提取卵黄加入离心管中，加入2ml磷酸盐缓冲液，混合后加入4ml氯仿，充分振荡混匀，室温放置1h，期间搅拌混匀3次，再通过3000r/min离心10min，出现分层，上层为卵黄抗体提取液B，分离备用；(3)两种提取方式卵黄液的混合将步骤2所得到的卵黄抗体提取液A与B按等量比例混合得混合液，即为监测用卵黄抗体样品；(4)血凝试验在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS，吸取一定倍数稀释的抗原25μl加于第1列孔，充分混合后移出25μl至第2列孔，依次类推做等量倍比稀释至第11列孔，第11列孔弃去25μL；设立第12列孔为红细胞对照；每孔再加25μl PBS；每孔各加入0.75％鸡红细胞悬液25μl；立即置微型振荡器上混合1min，或手持血凝板绕圆圈混匀1min；在室温下作用30min，或在4℃下作用60min；观察数次，直至对照的红细胞全部沉淀为一个圆点，将血凝板倾斜，观察红细胞有无泪珠样流挂，根据血凝图像判定结果；血凝效价高于211时可继续增加稀释的孔数，以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝效价，此时血凝效价为2n，n>11，再根据初始稀释度计算抗原的血凝单位；并根据测定的抗原的血凝效价，计算4个血凝单位抗原的稀释倍数，制备4个血凝单位抗原；(5)血凝抑制试验与效价确认在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS；将步骤3的混合液，取体积25μl于第1列孔，混匀后由左向右顺序倍比稀释至第11列孔，最后弃去25μl；第1列孔至第12列孔分别加25μl含4个血凝单位的抗原；立即置微型振荡器上混合1min，或手持血凝板绕圆圈混匀1min；在室温下作用30min，或在4℃下作用60min；每孔加0.75％鸡红细胞悬液25μl；混合后置室温下作用40min或在4℃下作用60min，此时对照的红细胞已沉淀为一个圆点；血凝抑制效价高于211时可继续增加稀释的孔数，以完全抑制红细胞凝集的最大稀释倍数为该混合液的血凝抑制效价，测定抗体效价加上修订系数即为卵黄抗体替代血清抗体的血凝抑制效价；(6)主要试剂及配制PBS：配制20倍PB：称量5.157g Na2HPO4.12H2O和0.874g NaH2PO4.2H2O，加蒸馏水至100ml；配制1倍PBS：量取50ml 20倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸馏水至1000ml；用NaOH或HCl调pH值至7.2；121℃高压蒸汽灭菌15min；0.75％鸡红细胞悬液：采集至少3只SPF公鸡或新城疫抗体的健康公鸡的血液与等体积红细胞保存阿氏液混合，用前述PBS液洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min，洗涤后用前述PBS配成0.75％红细胞悬液，4℃保存备用，所述0.75％均为体积比。