[发明专利]一种检测galectin‑4的荧光酶联免疫分析方法

摘要

本发明涉及一种检测galectin‑4的荧光酶联免疫分析方法，该方法通过目标物质结合的酶标复合物上的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生过氧化氢，再加入亚铁离子溶液产生活性氧来淬灭金纳米簇溶液的荧光，利用荧光光谱仪测定荧光变化进行对目标分子的定量检测。本方法所用荧光金纳米簇发光稳定、对活性氧的响应灵敏，用作检测探针在可控性上更稳定、操作更方便。本方法所构建检测体系具有合成简单、成本低、灵敏度和稳定性高等优点，有望在临床生物分子检测上得到更广泛应用扩展。

主权项

一种检测galectin‑4的荧光酶联免疫分析方法，所述方法包括：(1)合成荧光金纳米簇；(2)固定葡萄糖氧化酶：将醋酸锌溶液或者硝酸锌溶液或者氯化锌溶液中的一种或者几种二价锌离子混合溶液与2‑甲基咪唑溶液混合，锌离子与2‑甲基咪唑溶液的摩尔浓度比为1:4，再加入葡萄糖氧化酶溶液至葡萄糖氧化酶浓度为0.25mg/mL，反应30分钟后，离心洗涤收集得GOx/ZIF‑8；将GOx/ZIF‑8分散于浓度10mM的Tris‑HCl缓冲液中加入多巴胺溶液至多巴胺终浓度为0.5mg/mL，进行自聚合反应1小时，离心洗涤收集得GOx/ZIF‑8‑PDA；将GOx/ZIF‑8‑PDA 200μL与2μL 1mg/mL的STV溶液于25μL pH 8.0的100mM PBS缓冲液中，4℃振荡反应过夜，离心洗涤收集得GOx/ZIF‑8‑PDA‑STV；(3)目标蛋白检测：(a)酶标板以包被稀释液包被待测蛋白，孵育后，再以洗涤液洗板；所述包被稀释液为10mM、pH 7.4的PBS；所述洗涤液组成如下：8g/L NaCl，0.2g/L KCl，0.05％Tween‑20，溶剂为50mM、pH 7.4的PBS；(b)加入封闭液进行封闭，再以洗涤液洗板；所述封闭液为1％BSA，溶剂为前述洗涤液；(c)加入生物素标记抗体孵育形成抗原‑检测抗体特异反应，再以洗涤液洗板；(d)再加入步骤(2)所得GOx/ZIF‑8‑PDA‑STV孵育，利用链霉亲和素与生物素特异结合将酶复合物链接至抗体上，再以洗涤液洗板；(e)加入5mM的葡萄糖溶液100μL孵育反应，37℃反应30分钟，生成过氧化氢；(f)将反应液转移至离心管；(4)在离心管中，分别加入硫酸亚铁溶液和步骤(1)合成的荧光金纳米簇，用荧光光谱仪分别检测溶液荧光值；(5)梯度浓度的Galectin‑4蛋白标准品按照步骤(3)、(4)方法进行检测，处理步骤(4)所得数据，绘制标准曲线；(6)根据待测蛋白的检测结果，对照标准曲线，获得待测蛋白的浓度数据。