[发明专利]一种DNApulldown方法及试剂盒

摘要

本发明涉及一种DNA pulldown方法及试剂盒。所述方法包含以下步骤S1、磁珠预处理使用BSA(牛血清白蛋白)和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；S2、制备探针‑磁珠复合物；S3、提取并预处理细胞核蛋白向提取核蛋白样品中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；S4、pulldown；S5、蛋白样品的收集。本发明具有如下有益效果本发明通过预先使用BSA、寡核苷酸随机引物封闭磁珠，降低了磁珠与蛋白、基因组DNA的非特异性结合。本发明通过系统性核酸酶防护，防止核酸酶的污染，增加了实验的稳定性和可靠性，重复性好，简化了实验流程。

主权项

一种DNA pulldown方法，其特征在于，包含以下步骤：S1、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；所述步骤S1磁珠预处理的方法为：用1mL 1×TES洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TES洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后去除TES溶液；所述TES中BSA的浓度为0.05‑0.5wt%，寡核苷酸随机引物的浓度为10‑20μmol/L；所述步骤S1中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列；S2、制备探针‑磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的DNA探针结合；S3、提取并预处理细胞核蛋白：向提取核蛋白样品中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；所述步骤S3提取细胞核蛋白的方法为：用含0.5mM PMSF的PBS洗涤1.5×107个细胞两次，每次4℃、1000rpm离心5min，弃上清；加入390μL预冷Buffer 1、4μL 10mg/mL 的PMSF溶液、4 μL protease inhibitor cocktail和2 μL100mM DTT溶液，重悬细胞后，剧烈涡旋10秒钟充分混匀，冰浴10min；4℃、1400g‑2500g离心5min，弃上清；加入390μL冷Buffer 2、4μL 10mg/mL 的PMSF溶液、4μL protease inhibitor cocktail和2μL 100mM DTT溶液，涡旋充分重悬沉淀，冰浴20min，每隔2min高速剧烈涡旋15‑30秒钟充分混匀；4℃、12,000g‑16,000g离心10min，弃沉淀，上清为核蛋白提取物；所述Buffer1的配方为：10 mM HEPES‑KOH、1.5 mM MgCl2、10 mMKCl、0.1mMEDTA和0.4wt% NP‑40；所述Buffer 2的配方为50 mM HEPES‑KOH、5 mM MgCl2、420 mMNaCl、0.1 mM EDTA和2wt% glycerol；S4、pulldown：将步骤S3制备的蛋白样品加入到步骤S2制备的探针‑磁珠复合物中，加入DNA precipitation buffer及脱氧核糖核酸酶抑制剂孵育，收集磁珠，用DNA precipitation buffer洗涤磁珠，得到蛋白‑探针‑磁珠复合物；S5、探针‑蛋白复合物的收集：将步骤S4制得的蛋白‑探针‑磁珠复合物加入Urea CHAPS buffer孵育，去除磁珠，收集上清即得探针‑蛋白复合物。