[发明专利]一种RNApulldown方法及试剂盒

摘要

本发明涉及一种RNA pulldown方法及试剂盒。所述方法包含以下步骤S1、磁珠预处理使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭含链霉亲和素的磁珠；S2、制备探针‑磁珠复合物；S3、提取并预处理细胞全蛋白向提取细胞全蛋白样品中加入核糖核酸酶孵育，再加入磁珠孵育，收集上清；S4、pulldown；S5、RNP的收集。本发明具有如下有益效果本发明通过预先使用BSA、寡核苷酸随机引物封闭磁珠，降低了磁珠与蛋白、RNA的非特异性结合。本发明通过系统性核酸酶防护，防止核酸酶的污染，增加了实验的稳定性和可靠性，重复性好，简化了实验流程。

主权项

一种RNA pulldown方法，其特征在于，包含以下步骤：S1、磁珠预处理：使用BSA和寡核苷酸随机引物封闭链霉亲和素标记的磁珠；所述步骤S1磁珠预处理的方法为：用1mL 1×TES洗涤80μL链霉亲和素标记的磁珠，去除TES洗涤液，再向磁珠中加入1mL含BSA和寡核苷酸随机引物的1×TES，室温孵育30min后去除TES溶液；所述TES中BSA的浓度为0.05‑0.5wt%，寡核苷酸随机引物的浓度为10‑20μmol/L；所述步骤S1中寡核苷酸随机引物为20bp以内的DNA序列；S2、制备探针‑磁珠复合物：将步骤S1预处理的磁珠与生物素标记的RNA探针结合；S3、提取并预处理细胞全蛋白：向提取的细胞全蛋白中加入脱氧核糖核酸酶孵育，再加入未预处理的磁珠孵育，去除磁珠，收集上清；所述步骤S3中预处理细胞全蛋白的方法为：向1.5×107个细胞提取获得的细胞全蛋白提取物中加入10μL DNase和3.2μL DNase Buffer，室温温和孵育1h；再加入40μL未预处理的磁珠，4℃温和旋转30 min；收集上清液为预处理的细胞全蛋白；S4、pulldown：将步骤S3收集的上清加入到步骤S2制备的探针‑磁珠复合物中，加入脱氧核糖核酸酶抑制剂和核糖核酸酶抑制剂孵育，收集磁珠，用含核糖核酸酶抑制剂的NT2 buffer洗涤磁珠，得到蛋白‑探针‑磁珠复合物；S5、RNP的收集：将步骤S4制得的蛋白‑探针‑磁珠复合物加入Urea CHAPS buffer孵育，去除磁珠，收集上清即得RNP。