[发明专利]一种检测少儿耳聋遗传风险的引物、试剂盒、检测方法

摘要

本发明公布了一种检测少儿耳聋遗传风险的引物、试剂盒及其操作方法，包括，1）提取DNA模板，提取口腔上皮细胞的基因组DNA；2）PCR扩增反应，反应体系总体积为25uL，PCR反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟；3）PCR产物纯化，反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟；4）DNA测序反应，使用DNA测序引物GCGTTTGGTCCTAGCCTTT，反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分钟。本发明所述检测方法，准确度高，操作简单，有很大的市场推广应用价值。

主权项

一种检测少儿耳聋遗传风险的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括PCR反应套装、PCR产物纯化套装、测序反应套装，所述PCR反应套装由以下组分组成，2.5uL 10X PCR反应缓冲液，0.2uL25mM dNTP混合液，25mM MgCl2溶液1.5ul，0.125ul 5units/ul Taq DNA聚合酶，20uM特异性引物：GCGTTTGGTCCTAGCCTTTC和GCATCTTTCCCTTGCGGTAC 0.25uL，去离子水19.175ul；所述PCR产物纯化套装：1uints/ulSAP酶0.75ul，10uints/ul Exo酶0.375ul，去离子水3.875ul；所述测序反应套装：25％BigDye mix 1μl，3.2μM DNA测序引物：GCGTTTGGTCCTAGCCTTT 1μl，125mM EDTA溶液1μl，100％乙醇溶液15μl，70％乙醇溶液30μl，HIDI溶液8μl，去离子水2μl；该试剂盒使用方法包括以下步骤，(1)提取DNA模板提取口腔上皮细胞的基因组DNA；(2)PCR扩增反应反应体系总体积为25uL，12.5ng/ul DNA模板1uL、10X PCR反应缓冲液2.5uL，25mM dNTP混合液0.2uL，25mM MgCl2溶液1.5uL，5units/uL Taq DNA聚合酶0.125uL，20μM特异性引物各0.25uL，去离子水19.175Ul；PCR反应条件为94℃、12分钟，进行30个循环的94℃、30秒，60℃、30秒，72℃、30秒，然后进行72℃、10分钟；(3)PCR产物纯化反应条件为37℃、15分钟，72℃、20分钟；(4)DNA测序反应使用DNA测序引物，反应体系为总体积5uL，包含PCR纯化产物1uL，25％BigDye mix 1uL，3.2μM DNA测序引物1uL，去离子水2uL，反应条件为98℃、2分钟，进行25个循环的96℃、30秒，55℃、30秒，60℃、4分钟，反应结束后加入125mM EDTA溶液1uL和100％乙醇溶液15uL，于室温下沉淀15分钟；在4℃以3650转/分的转速离心30分钟，轻轻倒去上清液；加入70％乙醇溶液30μl，以3650转/分的转速离心15分钟，轻轻倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8μl，放入测序仪中。