[发明专利]免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法

摘要

本发明公开了免疫检测点阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，包括以下步骤步骤1）采集外周血单状核细胞；步骤2）将上述分离的单状核细胞通过贴壁法进行DC和T的分离；步骤3）将贴壁的DC细胞加入含GM‑CSF、IL‑4的无血清培养制备成DC疫苗；步骤4）将悬浮的T细胞加入CD3和IL‑2进行T细胞培养和扩增；步骤5）在扩增的T细胞内加入负载抗原的DC细胞制备成CTL，同时加入PD‑1及CTLA‑4抗体制备成Dual‑block CTL效应细胞制剂。本发明提供了一种通过阻断肿瘤特异性CTL细胞表面的抑制性分子，有效调控“免疫刹车”效应并减缓“T耗竭”，从而大幅提高CTL效应细胞的肿瘤杀伤效应的新技术和新方法。

主权项

免疫检测点双阻断CTL高效率杀伤细胞制剂的制备方法，包括以下步骤：（1）单状核细胞的获取；（2）DC和T细胞的分选；（3）DC扩增和疫苗的制备；（4）T细胞培养和扩增，具体包括：取细胞培养瓶，加入含CD3单抗500ng/ml的无血清培养基AIM‑V，将分选获得的T细胞加入培养瓶，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中过夜，次日半量补充含500IU/ml IL‑2的AIM‑V培养基（IL‑2培养基），后每3天补充IL‑2培养基40%以上，进行扩增培养；（5）T细胞活化和Dual‑block CTL制备，具体包括：第7天DC疫苗收获后，按DC:T=1:20的比例将DC疫苗加入T细胞培养瓶中共培养，使T细胞活化并制备成肿瘤特异性CTL效应细胞；第8天加入抗人PD‑1单抗3‑15ug/ml及抗人CTLA‑4单抗3‑15ug/ml，进行效应细胞免疫检测点双阻断，每3天补充IL‑2培养基，培养10‑15天收获肿瘤特异性Dual‑block CTL效应细胞制剂，流式检测Dual‑block CTL表面PD‑1及CTLA‑4的表达持续低水平；所述效应细胞选自T细胞来源的各种CTL、TIL、NK、CIK、以及各种T细胞亚型等细胞。