[发明专利]干细胞制剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种干细胞制剂的制备方法，步骤如下取脐带组织、将组织培养、将间充质干细胞细胞传至P3代时，按8000cells/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入25ml的DF12完全培养基；待细胞长至90％左右融合时，用10mL PBS缓冲液冲洗细胞表面3次；重悬、消化清洗然后检测、冻存。本发明提供的干细胞制剂的制备方法的P4代脐带间充质干细胞具有细胞数量多，表型稳定。本发明提供的干细胞制剂的制备方法用细胞筛过滤细胞制剂，将成团细胞过滤掉，防止细胞成团。

主权项

一种干细胞制剂的制备方法，其特征在于：步骤如下：⑴取足月健康胎儿脐带，用胶体金、荧光定量PCR相结合的方法检测脐带血清HbsAg，抗‑HCV，HCV‑RNA,抗‑HDV，抗HEV，抗‑HIV‑1/2，HIV‑1‑RNA,CMV‑DNA，检测结果均为阴性的脐带备用；⑵将脐带从采集瓶中取出，置于无菌平皿中，用无菌手术剪剪成3‑7cm的小段；⑶将脐带段浸没于无菌烧杯中，用PBS反复清洗残留在血管内的血液，直至清洗后的PBS基本无色为止；⑷将清洗后的脐带转移到弯盘中，使用手术剪或手术刀将其剪切成1‑5mm的小块，均匀平铺到T75培养瓶底部；⑸将平铺好脐带组织块的培养瓶放入二氧化碳培养箱内，干燥30分钟；⑹往培养瓶中缓慢加入含10％添加物的培养基，培养基的用量为浸没组织块且液面平齐；⑺每6天换液1次，期间观察组织贴块边缘细胞生长情况，待多数组织块细胞爬出且每个块组织块周围的细胞生长至80％左右融合时，进行脐带间充质干细胞的原代传代；⑻将间充质干细胞细胞传至P3代时，按8000cells/cm2的密度接种于T175培养瓶中，加入25ml的DF12完全培养基；⑼待细胞长至90％左右融合时，用10mL PBS缓冲液冲洗细胞表面3次；⑽吸尽PBS缓冲液，加入5mL胰蛋白酶消化，轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶覆盖瓶底，迅速在镜下观察，待细胞皱缩成球状时轻轻拍打培养瓶外侧使细胞漂浮起来；⑾用移液管移取两倍胰蛋白酶量的培养基至培养瓶中，终止消化；⑿收集细胞悬液，1200rpm，9升8降离心6min；⒀用移液管将离心后的上清液移弃，用40mL生理盐水重悬细胞，注意轻轻吹打，避免产生气泡，离心，重复操作4次；⒁最后一次离心后，用移液管将离心后的上清液移弃，用10mL生理盐水重悬细胞，细胞筛过滤细胞悬液；⒂取0.1mL过滤后的细胞悬液，用血球计数板计数，计算所需细胞量的细胞悬液体积；⒃取1*106细胞悬液做流式；(17)取100mL无菌生理盐水，用注射器抽出与所需细胞悬液体积相等的生理盐水；(18)将细胞悬液打回100mL生理盐水袋中，轻轻颠倒生理盐水袋混匀细胞；(19)加入人血白蛋白，分别在0h、4h计数，计算细胞活率；(20)制剂4℃储存分别在0h、2h、4h、6h、24h计算细胞活率。