[发明专利]一种快速高效同时检测土壤、污泥中11种抗生素含量的方法

摘要

本发明提供了一种同时检测土壤中11种抗生素的方法，采用UPLC‑MS/MS方法检测抗生素，以加标法确定检测方法的回收率。本方法主要采用SAX与HLB小柱串联的形式对提取的抗生素进行萃取纯化，使用UPLC/MS/MS检测。本发明所述方法是一种回收率高，重复性好，能够快速批量同时检测土壤中抗生素的新型方法，步骤简便，快速，所检测抗生素10分钟内全部分离开，检测限低，适于低含量的抗生素检测，为检测环境中抗生素污染，监测抗生素含量，研究抗生素降解转化机理，提供了便捷条件。

主权项

1.一种快速高效同时检测土壤、污泥中11种抗生素含量的方法，其特征在于，包含以下步骤：（1）土壤、污泥样品的采集、保存与前期处理采集0~20cm表层土壤在‑20℃条件下避光保存，对于底泥，采集保存时注意赶出空气，使用冷冻干燥机冷干，研磨过40目筛子，‑20℃冷藏；（2）配制土壤、污泥抗生素提取液称取含有两个结晶水的磷酸二氢钠3.12g，加入200μL浓磷酸，用超纯水定容至100ml，得到pH=3的磷酸缓冲溶液；将色谱级乙腈与磷酸缓冲溶液按照体积比7：3混合，得到土壤、污泥提取液;（3）提取土壤、污泥中抗生素称取土壤或污泥样品1g，精确到0.0001g，于50ml离心管中，依次加入0.2gNa2EDTA和10mL土壤、污泥抗生素提取液，涡旋1分钟，超声10分钟，离心,8000转,15分钟，收集上清液，此过程共重复3次，将得到的上清液合并后，用超纯水稀释至400ml，使用0.45μm有机相微孔滤膜抽滤，（4）固相萃取富集并浓缩抗生素使用SAX和HLB小柱进行固相萃取：将SAX柱和HLB柱通过SPE连接柱小件连接起来置于固相萃取真空装置上，依次使用6ml色谱级甲醇和6mL超纯水对小柱进行活化和冲洗，随后，使用大容量采样管将抗生素提取液与固相萃取柱连接，打开真空泵进行固相萃取，结束后，用超纯水清洗固相萃取小柱，真空干燥30分钟，弃去SAX小柱，使用2×5mL色谱级甲醇将抗生素从HLB小柱中洗脱于15mL试管中，50℃水浴条件下高纯氮气吹至近干，添加1mL色谱级甲醇再次溶解抗生素后，使用0.22μm针式滤膜转移至2mL进样小瓶中，上机测定，（5）UPLC/MS/MS检测将待测提取液通过UPLC/MS/MS进行分析检测，测定的色谱条件为：采用BEH‑C18色谱柱，2.1×100mm，二元梯度泵；MS/MS检测器；流动相A为0.5%的甲酸，流动相B为乙腈；进样体积10μL；流速0.4mL/min；柱温50℃；梯度洗脱顺序：0~1.5min，90%~84%A；1.5~2min，84%~82%A；2~2.5min，82%~80%A；2.5~3min，80%~78%A；3~4min，78%~65%A；4~4.5min，65%~40%A；4.5~5min，40%A；5~6.5min，40%~5%A；6.5~7min，5%~90%A；7~10min，90%A;质谱条件为：氯霉素采用负离子模式，锥孔电压34V，碰撞电压16V，定性判定母离子质荷比为321.00，子离子质荷比为151.97；氟苯尼考采用负离子模式，锥孔电压16V，碰撞电压18/8V，定性判定母离子质荷比为356.03，子离子质荷比为185.05/336.00；呋喃唑酮采用正离子模式，锥孔电压46V，碰撞电压20/22V，定性判定母离子质荷比为226.07，子离子质荷比为67.08/122.06；恩诺沙星采用正离子模式，锥孔电压10V，碰撞电压24V，定性判定母离子质荷比为360.2603，子离子质荷比为342.2815；氧氟沙星采用正离子模式，锥孔电压为12V，碰撞电压为30V，定性判定母离子质荷比为362.2395，定性判定子离子质荷比为261.2175/318.2567；土霉素采用正离子模式，锥孔电压为10V，碰撞电压为26V，定性判定母离子质荷比为461.2439，定性判定子离子质荷比为426.2635；红霉素采用正离子模式，锥孔电压为6V，碰撞电压为34/34V，定性判定母离子质荷比为734.4931，定性判定子离子质荷比为158.1931/576.5374；磺胺嘧啶采用正离子模式，锥孔电压为6V，碰撞电压为24V，定性判定母离子质荷比为251.1482，定性判定子离子质荷比为156.0689；磺胺甲恶唑采用正离子模式，锥孔电压为4V，碰撞电压为24V，定性判定母离子质荷比为254.148，定性判定子离子质荷比为156.0694；氨苄青霉素采用正离子模式，锥孔电压为32V，碰撞电压为16/16V，定性判定母离子质荷比为350.08，定性判定子离子质荷比为106.1/174.06；四环素采用正离子模式，锥孔电压为4V，碰撞电压为24/22V，定性判定母离子质荷比为445.249，定性判定子离子质荷比为154.1075/410.1938，（6）计算分离出的抗生素对应的峰面积，根据标准曲线进行定量计算，得出抗生素含量。