[发明专利]一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法

摘要

本发明公开了一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼胚胎的制备；步骤二：dCas9‑Eve融合蛋白的表达载体构建；步骤三：进行sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9和基因的体外转录，再将体外转录合成的sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9mRNA和基因mRNA用RNeasy Mini Kit进行纯化；步骤四：sgRNA的活性鉴定；步骤五：dCas9‑Eve法敲降多拷贝基因znfl1s的表达，用胚胎整体原位杂交法通过检测基因的表达，判定基因表达被敲降的情况。本发明利用dCas9‑Eve的方法，在有效靶向识别基因启动子的sgRNA存在的情况下，可特异敲降基因的转录，避免了在研究基因在胚胎早期发育中受MO毒性或者脱靶导致的非特异性表型的影响，而且Eve抑制转录结构域是斑马鱼来源的，因此dCas9‑Eve可以适用于对任何斑马鱼基因在转录水平的敲降。

主权项

1.一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼胚胎的制备；步骤二：dCas9‑Eve融合蛋白的表达载体构建，将编码dCas9的cDNA序列与编码Eve的cDNA序列重组时，在二者之间置入一个linker序列，所述Eve的DNA序列如SEQ ID No.1所示；步骤三：进行sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9和znfl1s基因的体外转录，再将体外转录合成的sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9mRNA和znfl1s基因mRNA用RNeasy Mini Kit进行纯化；步骤四：sgRNA的活性鉴定，将sgRNA和Cas9mRNA同时注射入1‑细胞期斑马鱼胚胎，待胚胎发育至24hpf，收集5个胚胎，用金属镊子撕去壳膜，放入PCR管中，运用斑马鱼基因型鉴定试剂盒快速提取基因组DNA，再用可扩增出含sgRNA识别序列的基因启动子正向引物和反向引物为扩增引物、以上述提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增，之后验证PCR产物大小是否与目的片段一致，并将PCR产物进行测序，判定sgRNA是否具有活性；步骤五：dCas9‑Eve法敲降znfl1s的表达，将鉴定有活性的sgRNA以终浓度50ng/μl和250ng/μl dCas9‑Eve进行混合，然后显微注射入1‑细胞期的斑马鱼胚胎，待胚胎发育至8hpf，用胚胎整体原位杂交法通过检测基因的表达，判定基因表达被敲降的情况。