[发明专利]一种耐热细胞溶解素及其在烟草薄片制备工艺中的应用

摘要

本发明公开了一种耐热细胞溶解素及其在烟草薄片制备工艺中的应用。所述的细胞溶解素是将SEQ ID NO.1所示的耐热细胞溶解素基因克隆到大肠杆菌中，再通过蓝白斑筛选含有该耐热细胞溶解素基因的阳性克隆子，最后对阳性克隆子进行诱导表达，即得。本发明的细胞溶解素在高温条件下仍然具有极高的活性，其最适活性温度为50‑85℃，适应于烟草原料浸提的高温工艺，能够用于协助制备烟草薄片，提高浸提效率。实验结果表明，本发明的细胞溶解素参与到烟草三次浸提和打浆过程中，能够使薄片制备过程中的浸提液中蛋白质含量降低、可溶性总糖增加；制备成型的薄片经过检测后木质素含量有所减少，通过评析后烟草香味物质增加，杂气减少。

主权项

一种利用耐热细胞溶解素制备烟草薄片的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）在烟草原料中加入水和含有耐热细胞溶解素的溶液，在55‑75℃条件下浸提1‑2h，过滤，得到一级浸提液和一级烟草固体物；（2）在一级烟草固体物中加入水和含有耐热细胞溶解素的溶液，在55‑75℃条件下浸提5‑10min，过滤，得到二级浸提液和二级烟草固体物；（3）重复步骤（2），得到三级浸提液和三级烟草固体物；（4）合并一级浸提液、二级浸提液和三级浸提液，离心除去杂质，取上清液浓缩至26波美度，得到烟草浸提浓缩液；（5）将三级烟草固体物打浆、抄造，制得烟草薄片片基，再将烟草浸提浓缩液涂布至烟草薄片片基上，干燥，制得烟草薄片；所述的含有耐热细胞溶解素的溶液的制备方法为：（1）将耐热细胞溶解素基因连接至载体，构建重组质粒；（2）将重组质粒转化到大肠杆菌感受态细胞中，通过蓝白斑筛选含有该耐热细胞溶解素基因的阳性克隆子；（3）将阳性克隆子单菌落接种至LB液体培养基5ml上，37℃培养过夜，得到大肠杆菌菌液，﹣20℃保存备用；（4）将﹣20℃保存的大肠杆菌菌液10μl接种至LB液体培养基100ml中，37℃培养过夜；（5）将步骤（4）培养过夜的菌液2ml接种至LB液体培养基2000ml中，37℃振荡培养至菌液OD600为0.6，降温至18℃；（6）在步骤（5）的菌液中加入IPTG至IPTG终浓度为0.5mM，18℃继续振荡培养至OD600达到1.0，离心，收集菌体沉淀；（7）将菌体沉淀悬浮于50ml预冷的NTA‑0缓冲液中，冰浴，超声破碎菌体，离心，收集上清液，即得；所述的耐热细胞溶解素基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。