[发明专利]一种用人微血管内表皮细胞ICAM-1蛋白表达量检测凉茶抗炎活性的方法

摘要

本发明涉及一种用人微血管内表皮细胞ICAM‑1蛋白表达量检测凉茶抗炎活性的方法。发明点在于，不通过RNA提取，直接将HMEC‑1细胞表面ICAM‑1蛋白用荧光抗体标记后，通过流式细胞仪检测其表达量，具体为：将HMEC‑1细胞接种在细胞培养板中，待细胞长至单层，用凉茶检测液与细胞孵育，再用LPS处理细胞，诱导发生炎症，发生炎症细胞表面ICAM‑1蛋白表达量显著增加，将凉茶检测液孵育细胞后，ICAM‑1蛋白的表达量受到抑制。利用荧光标记ICAM‑1抗体标记细胞表面ICAM‑1蛋白，用流式细胞仪定量检测凉茶检测液对发炎细胞表面ICAM‑1蛋白的表达量，以蛋白的表达量作为衡量凉茶检测液抗炎效果的指标。

主权项

1.一种利用人微血管内表皮细胞ICAM-1蛋白表达量检测凉茶抗炎活性的方法，其特征在于，不通过RNA提取，直接将HMEC-1细胞表面ICAM-1蛋白用荧光抗体标记后，通过流式细胞仪检测其表达量，包括下列步骤：(1)凉茶检测液的配制：以mg/L计(1)以干燥的植物原料计，称取鸡蛋花10g，金银花10g，菊花10g，布渣叶20g，甘草20g，夏枯草10g，分别用200倍重量的水浸泡30min，插上电煎药壶在100℃下煎煮1h，85-95℃下煎煮1h，重复前述方法煎煮一次，分别用定性滤纸过滤，合并两次滤液，减压抽滤并收集滤液；(2)将步骤(1)中得到的滤液，分别在-0.1MPa，65℃下旋转蒸发浓缩成浸膏，取出浸膏，于-20℃下冻结，再用真空冷冻干燥机处理冻结后的浸膏，得到凉茶粉末，保存于-20℃下；(3)称取步骤(2)所得的凉茶粉末100mg/样本，用10ml的MCDB131基础培养基溶解，配成10mg/ml的凉茶母液，用0.22μm无菌滤膜过滤后分装，于-20℃保存备用，保存时间不超过14d；(4)配制1mg/ml的脂多糖溶液作为HMEC-1细胞的诱导剂；配制1mM的雷公藤红素溶液，作为阳性对照药物；配制5mg/ml的噻唑蓝溶液，配制后的溶液用0.22μm无菌滤膜过滤后分装到无菌EP管，-20℃下保存备用；(5)配制磷酸盐缓冲液,在121℃高压蒸汽灭菌后于4℃下保存备用；(6)用步骤(5)配制的无菌磷酸盐缓冲液配制0.25mg/ml的胰酶，并添加0.02％的EDTA，用0.22μm无菌滤膜过滤后分装，于-20℃保存备用；(7)将生长状态良好的HMEC-1细胞，用细胞计数板计数后，接入96孔细胞培养板上，细胞培养板按0.1ml/孔的量添加MCDB131培养基，附加10％的胎牛血清，1μg/ml的氢化可的松和10ng/ml的重组人表皮生长因子，在37℃，5％CO2条件下培养HMEC-1细胞；(8)待HMEC-1细胞长至单层，弃去旧的MCDB131培养基，更换如步骤(7)所述的新鲜MCDB131培养基，在凉茶检测组细胞培养孔中分别加入步骤(3)中配好的凉茶检测液，使终浓度分别为1.6mg/ml、0.8mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml和0.1mg/ml的梯度浓度，每个浓度设6个重复孔，在37℃，5％CO2条件下培养24h后，每孔加入步骤(4)配制的噻唑蓝10μl，继续培养4h，然后取出培养板包上锡箔纸避光，在4000rpm离心3min，小心弃去上层培养基，再在通风环境中加入二甲基亚砜100μl/孔，避光震荡5-10min；在酶标仪上检测各孔在OD490的吸光值，计算评估药物对细胞的毒性；(9)将步骤(7)中生长状态良好的HMEC-1细胞接到24孔细胞培养板中，按步骤(7)添加MCD131培养基，于37℃，5％CO2条件下培养，待细胞长至单层，弃去旧的MCD131培养基，每孔更换新鲜的如步骤(7)所述的MCD131培养基0.5ml，设置空白对照组,单独脂多糖组，脂多糖+雷公藤红素组和脂多糖+凉茶检测组，脂多糖+凉茶检测组细胞培养孔中分别加入步骤(3)中配制的凉茶检测液，使终浓度控制在步骤(8)检测结果中且对细胞没有毒性的浓度范围，即0.01mg/ml、0.1mg/ml、0.25mg/ml和0.5mg/ml；在脂多糖+雷公藤红素组加入步骤(4)配制的终浓度为1μM的雷公藤红素；将凉茶检测液和雷公藤红素预先孵育HMEC-1细胞3h，除空白对照组外，其余组均加入步骤(4)中配制的终浓度为1μg/ml的脂多糖，继续培养HMEC-1细胞至12h；(10)在步骤(9)结束前30min，用步骤(5)配制好的磷酸盐缓冲液配制细胞标记缓冲液，即磷酸盐缓冲液中继续添加0.5％质量体积的牛血清蛋白和10mM MgCl2，在冰上孵育至少15min；(11)将步骤(9)中处理后的HMEC-1细胞，弃去旧培养基，用步骤(5)配制的无菌磷酸盐缓冲液洗涤3次，每孔加入50μl步骤(6)配制的胰酶溶液，37℃孵育3-4min，然后每孔加入150μl步骤(7)所述的MCDB131培养基，中和胰酶的消化反应，收集各个孔的HMEC-1细胞转移至96孔尖底细胞培养板中，3000rpm离心3min，弃去上清，按200μl/孔的量加入步骤(10)配制并预冷的细胞标记缓冲液，在室温下孵育30min，封闭多余位点；在3000rpm离心3min，弃去上清，每孔按20μl的量加入鼠抗人ICAM-1单克隆抗体，在室温下孵育30min，再加入150μl细胞标记缓冲液，在3000rpm离心3min，弃上清，按20μl/孔加入PE标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体，避光孵育15min，每孔加入150μl细胞标记缓冲液，在3000rpm离心3min，弃去上清液，立即用流式细胞仪检测，或在4℃下避光保存HMEC-1细胞，保存时间不得超过4h；(12)用于流式细胞仪检测的每个样品至少收集5000个HMEC-1细胞，设定激发波长为576nm，吸收波长为488nm，检测细胞平均荧光强度，以细胞荧光强度的数值关联ICAM-1蛋白的表达量。