[发明专利]一种测量刀鲚GnRH-R含量的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种测量刀鲚GnRH‑R含量的方法及其应用，包含以下步骤：(1)绘制GnRH‑R标准品标准曲线，所述标准曲线是492nm条件下的绝对吸光度值与GnRH‑R浓度的关系曲线；(2)通过ELISA方法检测待测样品的吸光度值，根据标准曲线计算GnRH‑R的含量。与现有技术相比，本发明具有以下优点：(1)本发明所述测量刀鲚GnRH‑R含量的方法快速、准确，且灵敏度高；(2)所述方法检测过程中克服了以往采用同位素标记的手段，因而减少了放射性污染；(3)所述方法为探明鱼类等低等脊椎动物生殖周期调控机制奠定基础；(4)所述方法具有高特异性，能够检测痕迹量的GnRH‑R酶。

主权项

1.一种测量刀鲚GnRH‑R含量的方法，其特征在于，包含以下步骤：（1）绘制GnRH‑R标准品标准曲线，所述标准曲线是492nm条件下的绝对吸光度值与GnRH‑R浓度的关系曲线；（2）通过ELISA方法检测待测样品的吸光度值，根据标准曲线计算GnRH‑R的含量；所述标准曲线中GnRH‑R标准品的浓度范围为0～32 mIU/mL，绝对吸光度值范围为0～1.3907；所述待测样品为从刀鲚的血液中分离纯化获得的GnRH‑R蛋白；所述ELISA方法的具体步骤为：（1）抗体包被：利用DE‑52液相色谱层析柱从家兔血清中层析获得anti‑GnRH‑R蛋白，转移至聚苯乙烯96孔微量滴定板中，加入 PBS缓冲液，水浴包被和孵育；（2）封闭：三步洗涤：PBS‑T缓冲液连续洗涤、等体积的PBS缓冲液洗涤、PBS‑1% BSA缓冲液洗涤后， 37℃培养4小时或在4℃过夜培养；（3）样品孵育：PBS‑T洗涤、PBS洗涤后，在96孔板中加入样品，连续用PBS‑BSA稀释，将稀释液加到酶标板中，37℃孵育4小时；（4）生物素标记的anti‑GnRH‑R孵育：用缓冲液对步骤（3）孵育后的样品进行1:400的稀释，缓冲液为含有0.1% BSA，0.1% Tween缓冲液和0.002%硫柳汞的混合溶液，pH值调整为7.0，稀释完成后加入生物素标记的抗体，37℃孵育3‑4小时；（5）链霉亲和素‑辣根过氧化物酶共轭培养：按照步骤（3）所述洗涤方法再次洗涤滴定板，向各孔中加入链霉亲和素‑辣根过氧化物酶，37℃孵育4‑6小时；（6）酶法显色反应：按照步骤（3）所述方法洗涤步骤（5）孵育后的滴定板，室温黑暗环境中染色，测定492nm处的吸光度值；其中，步骤（5）中加入的链霉亲和素‑辣根过氧化物酶是经PB‑BSA‑T按1:2000稀释后的产物；步骤（6）中酶法显色反应的具体步骤为：在每孔中加入邻苯二胺，具体为含有0.02％过氧化氢的3 mg/mL 0.1M的柠檬酸‑磷酸盐缓冲液，pH值为5.0；并通过HCl终止反应。