[发明专利]一种原代人食管上皮细胞的分离及培养方法

摘要

本发明提供了一种原代人食管上皮细胞的分离及培养方法，包括以下步骤：(1)无菌取出食管癌患者手术切除的正常食管2cm；(2)沿长轴纵行切开，展平，修剪去除皮下结缔组织和肌肉，以预冷含双抗的PBS缓冲液反复冲洗；(3)加入中性蛋白酶消化；(4)剥离上皮层和基底层；(5)将上皮层组织剪碎，加入胶原酶消化；(6)终止消化，过滤，离心，洗涤，用条件培养基重悬，接种培养瓶；(7)置于37℃，5％CO2培养箱培养；(8)细胞传代和纯化；(9)细胞形态观察与鉴定。本发明提供的一种人食管上皮细胞的分离及培养方法，操作简单，稳定，高效，为进一步研究食管黏膜上皮分化，食管病理生理、毒理学及癌发生机制等提供了良好的实验材料。

主权项

1.一种人食管上皮细胞的分离及培养方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)无菌取出食管癌患者手术切除的正常食管2cm，沿长轴纵行切开，展平，修剪去除皮下结缔组织和肌肉，再以预冷含双抗的PBS缓冲液反复冲洗后，置于此种双抗PBS缓冲液中浸泡10min；(2)加入10ml中性蛋白酶消化，剥离上皮层和基底层；(3)将上皮层组织剪成1mm×1mm×1mm组织碎片，加入I型胶原酶消化；(4)用含胎牛血清和双抗的H-DMEM完全培养基终止消化，经过200目不锈钢筛网过滤，滤液1200～1500rpm离心5min，去掉上清液，保留沉淀；(5)条件培养基配制：K-SFM无血清培养基中加入表皮生长因子，牛脑垂体提取物，氢化可的松和普通胰岛素，青霉素，链霉素；(6)沉淀加条件培养基重悬，接种胶原包被的25cm2培养瓶，于37℃、5％CO2培养箱培养；(7)接种24h后换成含FibrOutTM成纤维抑制剂的条件培养基，每隔2～3d换液；(8)细胞形态观察与传代；(9)细胞鉴定。