[发明专利]一种获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法

摘要

本发明公开了一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，本发明通过电穿孔的方法将供体载体和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，供体载体中NRAMP1基因自身启动子可以使NRAMP1实现在专职吞噬性细胞中的特异性表达，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR和Southern Blotting鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该转基因阳性克隆细胞为核供体，可获得转基因克隆胚胎，进一步将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，最终可以获得成活的NRAMP1定点插入转基因克隆牛。

主权项

1.一种NRAMP1巨噬细胞特异性表达打靶载体，其特征在于：该打靶载体包括目的基因NRAMP1以及用于将NRAMP1基因通过同源重组定点插入牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间的元件序列；所述元件序列包括用于打靶位点同源重组的同源臂序列，同源臂以牛基因组为模板扩增，扩增产物分别为牛25号染色体上打靶位点的上游序列777bp作为左侧同源臂和下游序列816bp作为右侧同源臂；所述左侧同源臂引物序列为：LA‑19T‑F：5'‑GCGGCCGCGTCTGACCCGTGAGTGTT‑3'；SEQ.ID.NO：36；LA‑19T‑R：5'‑GTCGACGCGGCTAGTTTGGGAGTG‑3'；SEQ.ID.NO：37；所述右侧同源臂引物序列为：RA‑19T‑F：5'‑ATCGATACACCCTTTCTAGTGGTCC‑3'；SEQ.ID.NO：38；RA‑19T‑R：5'‑AAGCTTTCCCGCTGATTGTTCTTC‑3'；SEQ.ID.NO：39；打靶位点位于牛25号染色体FSCN1和ACTB基因间，为SEQ.ID.NO：1序列内的394bp‑413bp；所述元件序列还包括筛选标记eGFP基因和PURO基因，以及位于所述筛选标记基因两侧的两个同向LoxP序列；所述筛选标记eGFP基因和PURO基因都由EF1α启动子启动转录，并由自剪切肽P2A序列串联融合表达。