[发明专利]一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法

摘要

本发明公开了一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法，包括功能化磁珠的制备、脲酶功能化金纳米探针的制备以及标准溶液和样品中CEA含量的检测，该方法也可用于检测甲胎蛋白（AFP）、胰胚胎抗原（POA）、同工酶（NSE）、激素（HCG）等；本发明方法具有操作简单，成本低廉，反应快速的特点，对待测物的定量检测仅需通过肉眼或者简单的紫外‑可见分光光度计即可进行，因而对推广比色免疫分析在临床诊断、医药分析和食品安全等方面的实际应用具有重要的意义。

主权项

1.一种用于非诊断目的的检测肿瘤标志物的比色免疫分析方法，其特征在于包括以下步骤：（1）功能化磁珠的制备取25mg/mL羧基化的磁珠4μL，在外部磁场的作用下，用50mM，pH=7.4的三（羟甲基）氨基甲烷‑盐酸缓冲盐溶液冲洗三遍，向冲洗后的磁珠中加入0.2M 的1‑乙基‑（3‑二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐和0.2M 的N‑羟基丁二酰亚胺的混合溶液200μL，室温震荡反应30min以活化磁珠表面的羧酸基团，将活化后的磁珠用50mM Tris‑HCl溶液冲洗三遍后重新分散于400μL浓度为50mM，pH=6.0的2‑(N‑吗啡啉)乙磺酸缓冲液中，再加入10μL浓度为1mg/mL 癌胚抗原CEA包被抗体，室温震荡反应3h，再加入200μL含2%（w/v）牛血清白蛋白的50mM，pH=7.4的Tris‑甘氨酸溶液，室温震荡封闭反应1h，在外部磁场作用下，将已进行功能化的磁珠用Tris‑HCl溶液洗净，重新分散于400μL浓度为50mM，pH=7.4的Tris‑HCl溶液中，于4℃保存待用；（2）脲酶功能化金纳米探针的制备取1mL直径为13nm的金纳米粒子于样品管中，用浓度为0.1M Na2CO3溶液调节至pH=8.5，依次加入5μL浓度为1mg/mL的癌胚抗原CEA标记抗体和100μL浓度为2mg/mL的脲酶，混匀组装1.5h后4℃下放置过夜，再将所得产物离心，除去多余的癌胚抗原CEA标记抗体和脲酶，将产物重新分散于0.8mL浓度为50mM，pH=7.4的Tris‑HCl溶液中，再向其中加入200μL含2%（w/v）的牛血清白蛋白溶液，室温封闭反应1h后，将得到的脲酶功能化的金纳米粒子经过离心洗净，分散于1mL浓度为50mM，pH=7.4的Tris‑HCl溶液中，于4℃保存待用；（3）标准溶液中CEA含量的检测分别取制备好的功能化磁珠40μL置于6个样品管中，将浓度为1mg/mL CEA标准溶液用50mM，pH=7.4的Tris‑HCl溶液分别稀释成浓度梯度为0.001，0.01，0.1，1，10，100ng/mL的CEA标准储备溶液，依次将上述6个不同浓度的CEA标准储备液100μL分别置于上述6个样品管中，在37℃震荡培育20min，在外部磁场作用下，用含0.05%（w/v）吐温的浓度为50mM，pH=7.4的Tris‑HCl溶液和Tris‑HCl溶液交替洗净，再分别向每个样品管加入100μL的脲酶功能化金纳米探针，在37℃震荡培育20min，将所得产物在外部磁场作用下洗涤三次后，再向样品管中加入浓度为0.25M的尿素和浓度为0.5M的Cu2+混合液100μL，37℃恒温震荡反应10min，再将所得产物用浓度为50mM，pH=7.4的Tris‑HCl溶液中清洗干净，再向其中加入10μL浓度为0.1M HCl溶液，静置反应5min后向其中加入100μL浓度为10μM铜离子检测试剂，所述铜离子检测试剂是溶于Tris‑HCl和四氢呋喃体积比为1/9的溶液中，首先通过肉眼初步观察颜色变化，初步判断标准品中CEA的浓度，再在外部磁场作用下，磁分离取上层清液在紫外可见分光光度计测定标准品中CEA的含量；（4）样品中CEA含量的检测取临床血清样品，每个样品分别进行5个平行试验，样品的处理方法同上述标准溶液，检测血清样品中CEA的含量。