[发明专利]羰基还原酶、突变体及其在制备抗真菌类药物中间体中的应用

摘要

本发明涉及羰基还原酶、突变体及其在制备抗真菌类药物中间体中的应用。具体公开了木糖发酵酵母羰基还原酶及其活性提高的突变体，其编码基因和氨基酸序列，含有该基因序列的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用所述木糖发酵酵母羰基还原酶或相应的重组表达转化体作为催化剂用于催化潜手性羰基化合物的不对称还原，特别是催化2‑氯‑2',4'‑二氟苯乙酮和2,2',4'‑三氯苯乙酮还原制备抗真菌化合物前体(R)‑2‑氯‑1‑(2',4'‑二氟苯基)乙醇和(R)‑2‑氯‑1‑(2',4'‑二氯苯基)乙醇的应用。与现有不对称还原的其他方法相比，本发明具有酶促反应底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等优势，具有很好的应用前景。

主权项

1.一种羰基还原酶，其特征在于，其是如下(a)或(b)的蛋白质：/n(a)由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质；/n(b)如下任一氨基酸序列组成的蛋白质：/n(1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸；/n(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第126位的缬氨酸替换为丙氨酸，第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸；/n(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸；/n(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第215位的甲硫氨酸替换为亮氨酸；/n(5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第130位的丝氨酸替换为甘氨酸；/n(6)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第130位丝氨酸突变为甘氨酸；/n(7)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第165位的甘氨酸替换为酪氨酸，同时第169位的苯丙氨酸突变为半胱氨酸；/n(8)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸；/n(9)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸；/n(10)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第136位的甘氨酸突变为丝氨酸；/n(11)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸；/n(12)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸，第158位的组氨酸突变为天冬氨酸，第290位的赖氨酸突变为精氨酸；/n(13)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸，第32位的丝氨酸突变为亮氨酸，第327位的赖氨酸突变为天冬酰胺；/n(14)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第57位的缬氨酸替换为天冬氨酸，第132位的脯氨酸突变为谷氨酸；/n(15)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸，第201位的赖氨酸突变为精氨酸；/n(16)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸，第235位的苯丙氨酸突变为丝氨酸；/n(17)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸，第164位的苯丙氨酸突变为酪氨酸；/n(18)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第64位的苯丙氨酸替换为亮氨酸，第308位赖氨酸突变为精氨酸，第130位的丝氨酸突变为甘氨酸，第243位的赖氨酸突变为精氨酸；/n(19)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第160位的缬氨酸替换为天冬氨酸；/n(20)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第126位的缬氨酸替换为异亮氨酸，第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸；/n(21)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第158位的组氨酸替换为天冬氨酸；/n(22)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第57位的缬氨酸替换为天冬氨酸，第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸；/n(23)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第165位的甘氨酸替换为酪氨酸；/n(24)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第169位的苯丙氨酸替换为半胱氨酸；/n(25)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第160位的缬氨酸替换为丙氨酸；/n(26)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为丙氨酸，同时第57位的缬氨酸替换为丙氨酸，第182位的赖氨酸突变为谷氨酸；/n(27)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第158位的组氨酸替换为脯氨酸；/n(28)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第127位的半胱氨酸替换为缬氨酸，第168位的谷氨酰胺替换为亮氨酸。/n