[发明专利]一种改造芽孢杆菌基因组的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种改造芽孢杆菌基因组的方法。本发明具有适应性广(质粒转化难度低，pBTS质粒可以在多种革兰氏阳性菌中进行复制，改造多种菌的基因组)，可以反复多次改造同一菌株(重组质粒具有两个同源重组片段，依次发生两次同源重组，第二次同源重组后可能恢复到野生型，也可以得到改造菌株，但是不残留任何影响继续改造的片段，如抗性标记、质粒复制元件等)，并且可以改造对细菌生长影响较大的基因(引入cre重组酶和第二种抗性标记系统，可依靠抗性筛选第二次重组得到的改造菌株，杀死生存能力强的野生型菌株，之后表达cre重组酶，切割掉第二种抗性标记，残留的片段不会影响再次对菌株进行改造)。

主权项

1.一种改造芽孢杆菌基因组的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)在pBAV1K‑T5‑GFP质粒的EcoR I和Apa I位点插入多克隆位点片段，并且通过同义突变，删除其中的NdeI酶切位点，得质粒pBTS；所述pBTS核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；(2)在多克隆位点的左端的酶切位点插入500‑800bp的同源重组片段A，右侧酶切位点插入500‑800bp的同源重组片段B，中间插入突变片段、目的片段或不插入任何片段，既两个同源重组区域之间需要改造的片段，得质粒pBTS‑X；(3)通过电转化将pBTS‑X转入芽孢杆菌中，得阳性转化菌株；(4)挑取(3)中的阳性转化菌落进入液体培养基中进行培养，培养温度为45℃，培养时间大于24h；(5)取步骤(4)中菌液100ul—500ul，涂布到含30mg/L卡那霉素的LB平板上，培养温度为45℃，进行过夜培养；(6)挑取步骤(5)中的菌落进入液体培养基中进行培养，每8—16h传代一次，直到筛选到无抗菌株；(7)取步骤(6)中的菌液进行稀释涂板，稀释10⁵‑10⁶倍，过夜培养；(8)挑取步骤(7)中的菌落进行抗性鉴定，直到获得5‑10株无抗菌株；(9)将无抗菌株接种到液体培养基中，过夜培养，抽提细菌基因组，进行PCR鉴定；阳性菌株继续进行测序鉴定，测序鉴定结果为阳性菌株即得芽孢杆菌菌株。