[发明专利]一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法

摘要

本发明公开了一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，通过对CcARF18基因的克隆、生物信息学分析、不同激素处理下转录水平表达量测定、亚细胞定位和维管束形成相关基因转录水平表达分析，确定了CcARF18基因在山核桃嫁接成活中以转录因子的形式起到抑制下游基因表达的作用，同时有助于进一步揭示CcARF家族影响山核桃嫁接成活的作用机制和山核桃嫁接过程生长素信号传导机制。为提高嫁接成活率奠定基础，有助于解决山核桃园艺化栽培困难的问题。

主权项

1.一种CcARF18基因克隆及对嫁接成活调控分析方法，其特征在于：包括以下步骤：A）材料准备：采用两种不同的激素：IAA 4mg/kg，NPA 0.3μg/l来处理山核桃嫁接苗，对照组采用清水处理，在嫁接后0d，3d，7d，14d采样，共36个不同样品，每个样品5个重复，取自不同组织，取样后立即用锡纸包好放入液氮灌，‑70℃存放备用；B）CcARF18基因克隆：b1）山核桃叶片总RNA提取：利用CTAB+Trizol法提取山核桃叶片总RNA；b2）cDNA合成：利用M‑MLV逆转录酶合成cDNA第一链；b3）CcARF18基因引物设计：根据前期转录组已测序获得的538bp CcARF18片段，设计三个扩增引物ARF18Rev、ARF18(5‑1)和ARF18(5‑2)；b4）RACE扩增：PCR反应体系：UPM 3μl，特异性引物3μl，Primer STAR Max DNA聚合酶25μl，双蒸水16.5μl，3’RACE‑Ready cDNA 3μl；RACE扩增的条件为：94℃2min；94℃30s，65℃30s，72℃2min30s，共35个循环；最后72℃延伸5min，琼脂糖电泳检测，胶回收纯化获得约2000bp目的片段，测序验证；C）CcARF18基因生物信息学分析：应用生物信息学软件对山核桃CcARF18基因进行理化性质的分析，对蛋白二级结构和三级结构进行预测，将山核桃CcARF18与拟南芥ARF家族和其他物种ARF基因进行进化树构建，对山核桃CcARF18基因进行进化多序列比对，确定其结构域并取ARF三个结构域中的MR区域，进行氨基酸含量分析；D）亚细胞定位：根据CcARF18基因全长序列，设计亚细胞定位引物，以Primer Star高保真酶体系PCR扩增，PCR后的产物和pCAMBIA1300‑GFP质粒使用Kpn I和Xba I进行双酶切，分别回收小片段和大片段，使用T4‑DNA连接酶连接，由此获得CcARF18‑GFP融合表达载体，使用电击法转化入农杆菌，最后使用下表皮注射将农杆菌注射入烟草叶片中，通过LSM510 共聚焦激光扫描显微镜观察绿色荧光蛋白的信号；E）不同激素处理下CcARF18基因和维管束形成相关基因转录水平表达分析：分别提取步骤A）中不同组织和不同嫁接时期取样的山核桃总RNA，并反转录合成cDNA第一链，根据CcARF18基因序列，利用Premier 3在线软件设计实时定量PCR引物，同时从山核桃cDNA数据库中，筛选了纤维素合成酶CesA3基因、H⁺ATPase形成关键基因AHA3、原形成层维管束标记基因HB8、细胞壁形成基因IRX5设计引物，进行荧光定量RT‑PCR，将qRT‑PCR结果制作成热图，采用2^‑ΔΔCt法计算平均值和标准差，对不同激素处理下CcARF18基因和维管束形成相关基因转录水平表达进行分析；所述的步骤b3）中扩增引物ARF18Rev序列为CGCTCCATA CCACCTTCACAAT，ARF18(5‑1)序列为CGGCGAAAGAAAGTGTTTTGGTGAA，ARF18(5‑2)序列为ACAAGTAC CAGCGAGGAACTCAGACA；所述的步骤b4）中特异性引物为步骤b3）中的扩增引物ARF18Rev、ARF18(5‑1)和ARF18(5‑2)，ARF18Rev、ARF18(5‑1)和ARF18(5‑2) 扩增引物各1μl；所述的步骤D）中亚细胞定位引物包括上游引物和下游引物，所述的上游引物序列为GGGGTACCATGATTACGGTGATGG ATTC，下游引物序列为TGCTCTAGAAGTCTGATTAACAGCACCTAC。