[发明专利]一种液质联用定量检测大鼠血浆中叶酸浓度的方法

摘要

本发明公开了一种液质联用定量检测血浆中叶酸浓度的方法。首先采用蛋白沉淀处理大鼠血浆样本，以格列本脲为内标运用高效液相色谱‑质谱联用(HPLC‑MS/MS)方法检测大鼠血浆中叶酸的含量。质谱采集方法选用ESI正离子及多反应监测模式(MRM)。该方法叶酸在10～1000ng/ml线性关系良好。方法的回收率在80.0％～95.4％范围内；批内和批间的准确度为92.7％～111.4％，批内和批间精密度为2.6％～8.3％。该方法重现性好，分析时间短，能满足叶酸在大鼠血浆中浓度的检测要求，可用于叶酸片剂药代动力学研究。

主权项

1.一种液质联用定量检测血浆中叶酸浓度的方法，其特征在于，包括步骤(1)样品制备，(2)采用液相色谱‑质谱联用检测，(3)标准曲线制备，(4)大鼠血浆中叶酸浓度测定；所述步骤(1)样品制备的步骤包括：取待测血浆样本进行蛋白沉淀；具体为向待测血浆样本中加入内标工作溶液，混匀，加超纯水，混匀，低温离心，取上清液；所述内标工作溶液中的溶剂为乙腈，内标为格列本脲；所述步骤(2)采用液相色谱‑质谱联用检测的步骤包括：(a)液相色谱条件液相采用Agilent 1260高效液相，色谱柱：C18柱；流动相：0.1％甲酸‑水A与乙腈B；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱梯度程序如下：0～0.5min，5％v/v B；2.2～3.2min，95％v/v B；3.21～6min，5％v/vB；(b)质谱条件质谱采用Agilent 6430三重四极杆质谱仪，电喷雾正离子源，多反应监测分析模式(MRM)；所述(a)液相色谱条件中，色谱柱为ThermoAccucore C18柱，50mm×2.1mm，2.6μm； 样品检测时间：6min；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；柱温：40℃；所述(b)质谱条件中，干燥气：N₂；干燥气流速：10L/min，干燥气压力：40psi，干燥气温度：350℃，毛细管电压：4000V；MRM监测方法参数如下：定量离子对叶酸：[M+H]+m/z 442.2/295.1，碎片电压：100V，碰撞能量：10eV；内标：[M+H]+m/z 494.2/369.0，碎片电压：130V，碰撞能量：9eV；所述(3)标准曲线制备的步骤包括：分别取一系列浓度的叶酸标准溶液10μl加入大鼠空白血浆90μl，涡旋得不同浓度标准样本溶液，按步骤(1)样品制备的方法制备，取上清液按步骤(2)采用液相色谱‑质谱联用检测的方法检测，记录每个浓度的叶酸对应的峰面积；以叶酸和内标的峰面积比值为纵坐标，以叶酸的浓度为横坐标X，制备叶酸的线性回归方程；所述(4)大鼠血浆中叶酸浓度测定的步骤包括：将待测血浆按步骤(1)样品制备的方法制备，取上清液按步骤(2)采用液相色谱‑质谱联用检测的方法检测，记录叶酸对应的峰面积，将叶酸和内标的峰面积比值代入所建的标准曲线中，计算得到所述待测血浆中叶酸的浓度。