[发明专利]一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法

摘要

一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，所述微流控芯片构成如下：上层为液路控制层，下层为气路控制层，底面为空白玻璃底板。基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法的步骤依次如下：①芯片预处理；②细胞的接种与培养；③药物刺激；④荧光染色。所有液路层入口均由一个气路层的阀单独控制，可同时进行不同种类细胞培养、不同药物刺激以及不同抗体染色。本发明利用微流控芯片中的微流体与微型阀技术实现了在微流控芯片上的药物筛选与荧光染色，为细胞培养、细胞原位荧光染色以及药物筛选研究提供全新的技术平台。本发明操作简便、细胞与试剂用量少、高度集成化、应用范围广泛。

主权项

一种基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法，其特征在于：所述集成化药物筛选与染色微流控芯片由上层、下层、底面三层顺序串联贴合布置组成，其中：上层为液路控制层，下层为气路控制层，底面为空白玻璃底板，；所述液路控制层具体设置有下述结构：——细胞荧光染色进样口：位于在整个液路控制层的最上游；——荧光染色进样通道区(P1)：布置在细胞荧光染色进样口和细胞进样通道区(P2)之间用于沟通二者；——细胞进样口：其设置有至少两个，每一个细胞进样口都设置在细胞进样通道区(P2)中的其中一条通道上，且前述细胞进样通道区(P2)中的每一条通道都串接着一个细胞培养室；——细胞进样通道区(P2)：设置在荧光染色进样通道区(P1)和细胞培养室之间；——细胞培养室：至少有二个，布置在细胞进样通道区(P2)和药物进样通道区(P3)之间；——药物进样通道区(P3)：其为包括覆盖所有细胞培养室和药物进样口之间的通道的区域；——药物进样口：其数量和细胞培养室相等，各自布置在每一个细胞培养室下游的通道上；——液体流出通道区(P4)：其布置在细胞培养室下游通道的下游和整个液路最尾端的出液口(13)之间；——出液口(13)：布置在整个液路控制层所有结构的最下游；基于微流控芯片的集成化药物筛选与染色方法具体要求如下：细胞荧光染色步骤如下：①从各个药物进样口分别吸出药物溶液，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；②从各个细胞进样口分别加入0.04g/mL预冷的多聚甲醛固定细胞，PBS冲洗2～5次，3～8min/次；③从各个药物进样口分别吸去多聚甲醛，从各个细胞进样口分别加入PBS冲洗2～5次，3～8min/次；④从各个细胞进样口分别加入表面活性剂Triton X‑100覆盖细胞10min，增加细胞膜的通透性，磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；⑤从各个细胞进样口分别加入血清封闭细胞15～60min；⑥在抗体加入之前，打开分别控制各个细胞进样口的气阀和分别控制各个药物进样的气阀；⑦打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，将骨桥蛋白一抗从细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室，孵育过夜；关闭用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；⑧次日，关闭控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口的气阀，将二抗从另一个细胞荧光染色进样口流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室，避光孵育0.5‑3h；关闭前述用于引入二抗的细胞荧光染色进样口；打开用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从该气阀对应的细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液冲洗2～5次，3～8min/次；⑨关闭前述引入磷酸缓冲液冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，打开另一控制细胞荧光染色进样口，将能够与DNA强力结合的荧光染料4',6‑二脒基‑2‑苯基吲哚从对应这一细胞荧光染色进样口入口引入并流经荧光染色进样通道(P1)加入细胞培养室；之后关闭前述用于控制细胞荧光染色进样口的气阀；打开前述引入磷酸缓冲液冲洗的用于控制细胞荧光染色进样口的气阀，从对应的用于控制细胞荧光染色进样口加入磷酸缓冲液清洗，通过荧光显微镜直观的观察细胞培养室中细胞经药物刺激后的生长状态以及荧光信号表达。