[发明专利]一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法

摘要

本发明公开了一种谷子SiARGOS基因的克隆、表达分析及功能标记的开发方法，克隆了谷子SiARGOS基因编码区及其启动子序列，序列分析发现SiARGOS基因开放阅读框342bp，编码114个氨基酸，其蛋白具有农作物ARGOS蛋白典型的富含亮氨酸结构域，启动子区域2109bp，含有与生长素、乙烯、茉莉酸和赤霉素等多种植物激素调控有关的元件。系统发育分析表明，谷子ARGOS蛋白跟玉米ARGOS蛋白同源性最高。表达分析发现，SiARGOS基因在晋29A，K186及其杂种F1的根中表达水平差异很大。SiARGOS基因等位变异分析发现，SiARGOS基因ORF存在1个SNP，启动子区存在19个SNP和2个InDel，共发现4个单倍型，我们开发了三个功能标记，其中包括1个CAPS标记和2个SSR标记。

主权项

一种谷子SIARGOS基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：通过拟南芥ARGOS的mRNA序列，在phtozome网站blast，得到谷子中的ARGOS序列，编号Si027037m，根据此序列，采用软件Primer Premier5.0设计包含该基因ORF的引物Siargos，引物序列为：Siargos‑1F：ACAAATCCCCACCCTTGTCA，Siargos‑1R：ACTCCTGAAAAGATGCTTCACA，以晋29A和K186的cDNA为模板，扩增得到PCR产物，经克隆测序后得到目标序列；PCR扩增总体积20μL包括：模板2μL，2×GC Buffer10μL，10mmol/L dNTPs0.4μL，2μmol/L特异引物4μL，rTaq DNA聚合酶0.2μL，双蒸水4μL；PCR扩增程序：首先，95℃预变性3min；然后，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存；取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳检测；根据phtozome网站序号Si027037m，将该基因向上游延伸2kb，用软件Primer Premier5.0设计启动子区PCR引物Argos‑Pro，引物序列为：Argos‑Pro‑F：CTCTGTCGTCTGCAAGCAA和Argos‑Pro‑R：ACTGACAAGGGTGGGGATTT，以晋29A和K186基因组DNA为模板，扩增体系和条件：除退火温度和延伸时间改为60℃退火30s，72℃延伸2min，扩增得到PCR产物，经克隆测序获得该基因启动子区序列：将获得启动子序列提交到PlantCARE，进行顺式作用元件的预测。