[发明专利]一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的方法

摘要

本发明公开了一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的方法，取驼峰藤幼嫩茎段及叶片作为外植体，消毒后接种到过渡培养基中，外植体在过渡培养基中培养一段时间，取未污染的叶片外植体转接到愈伤组织诱导培养基中诱导培养，诱导增殖，用增殖后的愈伤组织诱导不定芽；取未污染茎段外植体转接到不定芽诱导培养基中诱导培养，再转接于不定芽增殖培养基中诱导增殖，将分化出的不定芽接种于生根壮苗培养基中培养。对不同外源植物生长调节剂种类、浓度、搭配比例进行优化选择，确定对驼峰藤愈伤组织、不定芽诱导及其再分化成苗的影响，筛选出诱导驼峰藤培养基的配方，该组培无性快繁，能保持母株优良遗传性状。这对于驼峰藤资源保存和药物及园林开发利用有重要意义。

主权项

1.一种利用驼峰藤幼嫩茎段及叶片快速繁殖无菌苗的方法，其特征在于如下步骤：1）外植体培育：将驼峰藤种子经浸泡催芽处理后，播种于以椰糠：沙子=1:1为基质的苗床，小苗长至5.0 cm左右后移栽到大田，需要外植体材料时，用不锈钢剪刀剪取顶端新长出的茎段或叶片，作为外植体材料来源；2）外植体的获取及消毒：于晴天剪取长势良好的驼峰藤嫩茎和叶片，装入洁净塑料袋中，带回实验室，将茎剪成长3.0～4.0 cm的茎段即仅取茎尖顶端前4节、嫩叶剪成大小合适的方形组织块，置于洁净的烧杯中，用流水冲洗10～15 min，然后将茎段和叶片在洗洁精水中浸泡15 min左右，再用流水冲洗干净，冲洗后的茎段于超净工作台上，先用75%酒精浸泡20 s，用无菌水漂洗3次，后用0.1%升汞浸泡10 min，无菌水漂洗4次，每次1.5 min， 冲洗后的叶片于超净工作台上，先用75%酒精浸泡10 s，然后用无菌水漂洗2次，再于0.1%升汞中浸泡8 min，然后用无菌水漂洗4次，每次1.5 min，然后将消毒后的嫩茎和叶片放入事先准备好的无菌培养皿中，用无菌滤纸吸干材料上残留的水分，接种前将茎用无菌不锈钢刀片切成2.5～3.0 cm长的带腋芽茎段，以腋芽着生点为基准，上端长约1.0 cm，下端长1.5～2.0 cm，下端切成楔形；将消毒后的叶片切割成1.0 cm2左右，然后将切好的外植体接种到过渡培养基中，培养15~20 d后挑取无污染的外植体诱导愈伤组织或不定芽；3）叶片愈伤组织诱导：将过渡培养基中无污染的叶片外植体转接到愈伤组织诱导培养基中，接种时外植体横放，并轻压外植体材料使之与培养基充分接触；培养室温度24～26 ℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，一周后可见米白色或鲜绿色愈伤组织从切口处长出，待愈伤组织长到1.5 cm左右宽时，转入愈伤组织增殖培养基中诱导增殖；4）叶片愈伤组织增殖：将疏松、嫩绿色、长势良好的愈伤组织转接入愈伤组织增殖培养基上，用镊子轻压愈伤组织使之与培养基充分接触，培养室温度24～26 ℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，培养30 d后，可见愈伤组织大量长出； 5）不定芽诱导：将过渡培养基中无污染的茎段外植体转接到不定芽诱导培养基中，接种时将茎段竖直插入培养基中达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；将愈伤组织接种到不定芽诱导培养基中，诱导不定芽，接种时轻压愈伤组织，使之与培养基充分接触，培养室温度24～26℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，15 d后产生两种不定芽，一种是长度大于1.0 cm的单芽，另一种是带有愈伤组织，长度小于1.0 cm的丛生芽，待不定芽长到1.5 cm左右高时，即可转入不定芽增殖培养基中培养；6）不定芽增殖：将单芽苗切成1.5 cm左右长的小段，接种于不定芽增殖培养基中诱导增殖；将簇生态的丛生芽切成1.0 cm2左右，接种于不定芽增殖培养基中进行增殖培养，接种时将茎段竖直插入培养基中达0.5～1.0 cm，使之与培养基充分接触；培养室温度24～26 ℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h，培养15 d后，可见不定芽大量长出； 7）生根培养：选取高3.0~5.0 cm的不定芽，接种于生根培养基上培养30 d，即可得驼峰藤无菌苗；培养室温度24～26 ℃，湿度70～80%，光照强度1800～2000 lx，每天光照时间10～12 h；所述的以下步骤中：步骤2）中培养基为MS基本培养基，添加7 g/L卡拉胶、20 g/L的蔗糖，步骤3）中愈伤组织诱导培养基以MS为基本培养基，添加0.05 mg/L~0.10 mg/L的NAA、1.0~3.0 mg/L的6‑BA、0.10~0.20 mg/L的KT、30 g/L的蔗糖、7 g/L的卡拉胶，步骤4）中愈伤组织增殖培养基以MS为基本培养基，添加0.10 mg/L的NAA、1.0～2.5 mg/L的6‑BA、30 g/L的蔗糖、7 g/L卡拉胶，步骤5）中不定芽诱导培养基以MS为基本培养基，添加0.05 mg/L~0.15 mg/L的NAA、1.0~3.0 mg/L的6‑BA、0.05~0.10 mg/L的GA3、30 g/L的蔗糖、7 g/L的卡拉胶，步骤6）中不定芽增殖培养基以MS为基本培养基，添加0.15 mg/L的NAA、1.5～3.5 mg/L的6‑BA、30 g/L的蔗糖、7g/L卡拉胶，步骤7）中生根培养基以MS为基本培养基，添加0.1~0.5 mg/L的NAA、20 g/L的蔗糖、7 g/L卡拉胶。