[发明专利]一种具有漆酶活性的大球盖菇活性蛋白的制备方法

摘要

本发明公开了一种具有漆酶活性的大球盖菇活性蛋白的制备方法。本发明的活性蛋白以大球盖菇子实体为原材料，通过粉碎、超声波辅助浸提、硫酸铵盐析、超滤浓缩、离子交换层析、凝胶过滤层析、真空冷冻干燥等工艺制备而成。本发明的大球盖菇活性蛋白的相对分子质量为40KD，在体外对乳腺癌细胞MCF7具有增殖抑制活性。

主权项

1.一种具有漆酶活性的大球盖菇活性蛋白的制备方法，其特征在于所述的大球盖菇活性蛋白的相对分子质量为40KD，其制备方法包括以下步骤：（1）将干燥的大球盖菇子实体粉碎，过20~100目筛，即子实体粗粉；（2）将子实体粗粉按1:20~1:40（W/V）的比例，溶解于0.9%的氯化钠溶液，置于超声波提取器中，超声波频率控制在200W‑400W，2~10℃处理4~8h，6000~10000rpm离心10~30min，收集上清液，即子实体浸提液；（3）向子实体浸提液中加入硫酸铵至饱和度为60~80%，2~10℃处理4~8h，6000~10000rpm离心10~30min，收集沉淀，即蛋白粗提物；（4）将蛋白粗提物按1:5~1:15（W/V）的比例溶解于去离子水中，2~10℃、3000~4000rpm离心浓缩20~40min，反复2~4次，即蛋白浓缩液；（5）将蛋白浓缩液按1:10~1:20（W/V）的比例，溶解于10~100mM Tris、pH 7.0~9.0的Tris A缓冲液中，进行阴离子交换柱层析，用10~100mM Tris、1M NaCl、pH 7.0~9.0的Tris B缓冲液梯度洗脱，收集具有漆酶活性的洗脱峰；（6）将洗脱峰进行凝胶过滤层析，用10~100mM Tris、100~500mM NaCl、pH7.0~9.0的Tris C缓冲液洗脱，收集具有漆酶活性的洗脱峰；（7）将洗脱峰在‑20℃~‑40℃、8~12帕的真空下进行冻干，获得具有漆酶活性的大球盖菇活性蛋白。