[发明专利]一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法

摘要

本发明公开了一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法，适用于化妆品原料刺激性的评价，尤其适用于表面活性剂的眼刺激性评价。该方法利用受试物对细胞有刺激性时，细胞收缩，完全融合的细胞受到破坏，当荧光素作用于受损的细胞膜时根据漏出的荧光素量间接反映细胞膜的破坏程度，从而表征受试物的刺激性大小。该方法所用受试材料种群稳定，来源可靠，且融合速度快，容易形成细胞生长培养膜，为试验的稳定性提供保证；当用小鼠生细胞系统用于表面活性剂刺激性损伤评价时，与兔眼动物实验的结果相关性好。

主权项

一种利用小鼠肾细胞系统评价眼刺激性的方法，其特征在于包括以下步骤：一、小鼠肾细胞的制备取小鼠肾脏上皮，剪碎，研磨后用培养液冲洗，收集液体，经150目不锈钢网筛冲洗并收集网上肾细胞，加1g/L胶原酶I消化培养，37℃消化，每隔5min振荡1次，15min后加等体积含有10％牛胎血清的培养液终止消化，吹打分散细胞后静置5min，1000r/min离心5min，去除上清液，加入含10％牛胎血清的培养液，置于培养箱培养至细胞长满培养皿的85％以上，消化、冻存备用；二、小鼠肾细胞生长培养膜的制备取步骤一中冻存备用的对数生长期的小鼠肾细胞，调节细胞浓度为4×105～10×105个/mL，取0.5mL加入到插入式培养皿中的微孔滤膜表面上培养72～96h，待细胞完全融合后，得到小鼠肾细胞生长培养膜；三、荧光素渗漏试验3.1检测范围确定实验将0.4mL，0.01g/100mL、0.1g/100mL、1g/100mL、10g/100mL、20g/100mL、50g/100mL用PBS缓冲液稀释的受试物溶液到步骤二中的插入式培养皿中的小鼠肾细胞生长培养膜上，每个受试物浓度设置3孔平行对照，作用5～20min后，用Hank’s液轻轻冲洗细胞生长培养膜至其表面没有受试物；然后再将清洗之后的带有小鼠肾细胞生长培养膜的插入式培养皿放入另一含新鲜的10％牛胎血清的培养液的培养皿中，加入5～20μg/mL的等体积的荧光素钠溶液到插入式培养皿中的小鼠肾细胞生长培养膜上，37℃继续培养10～30min，然后用Hank’s液轻轻清洗细胞生长膜至其表面没有受试物，用荧光分光光度计检测含10％牛胎血清的培养液的培养皿中每孔培养基中的荧光素量；3.2荧光素渗漏试验从范围确定实验的结果得到使荧光素渗漏的效应发生的大概浓度范围，根据上述范围进行合理的间隔，按照几何对数或者最少设置六个浓度梯度，从而得到精确的评估荧光素漏出量的受试物初浓度，并依次确定以下指标：(1)受试物各浓度对应的3个平行孔荧光素漏出量的确定；(2)不加受试物的溶剂对照组的荧光素漏出量的确定；(3)无细胞生长培养膜的最大渗透组的荧光素漏出量的确定；(4)受试物浓度‑荧光素漏出率标准曲线的确定；(5)使荧光素漏出率为20％时的受试物浓度的确定；(6)接触受试物溶液后使荧光素漏出率为20％时的肾细胞生长培养膜继续培养4h、24h、36h、72h后的荧光素漏出率的确定；3.3荧光素渗漏试验结果分析实验获得反应小鼠肾细胞受损情况相关的三个参数：(1)FL(％)；代表不同受试物浓度下的荧光素漏出百分比，按以下公式计算不同受试物浓度下的荧光素漏出百分比：FL(％)＝(m‑y)/(z‑y)×100m表示受试物各浓度对应的3个平行孔荧光素漏出量的平均值，y表示同一块插入式培养皿不加受试物的溶剂对照组的荧光素钠漏出量的平均值，z表示同一块插入式培养皿无细胞生长培养膜的最大渗透组的荧光素漏出量的平均值；(2)D值：表示使不同百分比的荧光素漏出的受试物浓度，根据不同受试物浓度值和其相对应的荧光素漏出百分比，统计得出受试物浓度‑荧光素漏出百分比标准曲线，然后得出使20％的荧光素漏出的受试物实际浓度，即D20值；(3)FL20HY：表示接触受试物后引起20％荧光素漏出的肾细胞生长培养膜在含10％牛胎血清的培养液中继续培养Y小时后的荧光素漏出百分比在标准曲线上所对应的受试物浓度，根据3.2得到的荧光素漏出率为20％时的肾细胞生长培养膜继续培养Y小时后的荧光素漏出率，将其代入受试物浓度‑荧光素漏出百分比标准曲线，得出此时对应的受试物浓度，即FL20HY；其中Y为4、24、36或72；四、分类和判断根据上述预测模型对受试物眼刺激性及程度做出判断：根据预测模型实验得到的上述3个参数，根据以下分类标准，直接判断受试物的眼刺激性及其程度，(1)当FL(％)＝20时，FL20HY＞15g/100mL，无眼刺激性，相当于动物实验MMAS＜25；(2)当FL(％)＝20时，3g/100mL＜FL20HY≤15g/100mL，中度刺激性，相当于25＜MMAS＜55，(3)当FL(％)＝20时，FL20HY≤3g/100mL，重度刺激性，相当于动物实验MMAS＞55。