[发明专利]高香草酸均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法

摘要

本发明公开了高香草酸均相酶免疫检测试剂、制备方法及检测方法，属于免疫检测试剂技术领域。本发明制备的高香草酸免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗高香草酸特异性抗体，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；由该抗体制备得到的高香草酸检测试剂，可以精确快速地确定尿液等生物样品中的高香草酸含量。与市场上现有的检测试剂、检测方法、制备方法比较，本发明检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低高香草酸检测成本，有利于临床大规模推广使用。

主权项

一种高香草酸均相酶免疫检测试剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：(1)试剂A：将2.018～8.072g、5.625～22.50mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和0.856～3.422g、5.625～22.50mM葡萄糖‑6‑磷酸用0.5～2L 55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将抗高香草酸特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗高香草酸特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:300～1:6000；(2)试剂B：将高香草酸酶标偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，高香草酸酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:300～1:8000；所述高香草酸均相酶免疫检测试剂，含有抗高香草酸特异性抗体和酶试剂，所述的酶试剂由高香草酸酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物为葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶‑半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖‑6‑磷酸；所述的抗高香草酸特异性抗体由高香草酸免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与高香草酸特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物；所述的高香草酸免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽；其中，高香草酸酶标偶联物的制备方法包含以下步骤：(a)葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶溶液的制备：称取7.5～22.5mg规格为100KU的葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶，室温溶解于6～18mL含有72.6mg 0.05M Tris、8mg 3.3mM MgCl2和100mg NaCl的溶液中，pH＝8.5～9.0；在溶液中加入112.5～337.5mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、67.5～202.5mg葡萄糖‑6‑磷酸以及0.375～1.125mL卡必醇；加热到30‑35摄氏度，再一次性加入1～3mL二甲基亚砜，摇匀后静置5‑15s；(b)高香草酸的激活：在无水状态下称取5～15mg高香草酸，溶解于300～900μL二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到‑10～‑14℃；加入1.5～4.5μL三丁胺；加入0.75～2.25μL氯甲酸异丁酯；加入0.1～2μL碳二亚胺EDC；5～15mg N‑羟基硫代琥珀酰亚胺；‑10～‑14℃搅拌30～60分钟；(c)葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶与高香草酸的连接：将步骤(b)激活的温度为‑9～‑10℃的高香草酸溶液逐滴加入到步骤(a)溶解的温度为30‑35摄氏度的葡萄糖‑6‑磷酸脱氢酶溶液中；2‑8℃搅拌过夜；(d)纯化产物。