[发明专利]一种提高记忆的从血浆分离的混合物及其制备方法和应用

摘要

本发明属于分子生物学领域，提供一种提高记忆的从血浆分离的混合物及其制备方法和应用。所述混合物的SDS‑PAGE变性胶电泳具有11条肉眼清晰可见的条带，所述条带的分子量为：25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD。本发明提供的混合物可以比血浆和目前药物更有效地提升老年痴呆症患者的认知水平。与此同时，长期服用这种混合物可以大大降低长期服用西药带来的副作用和药物依赖。

主权项

1.一种提高记忆的从血浆分离的混合物，其特征在于：所述混合物的SDS‑PAGE变性胶电泳至少包括11条肉眼清晰可见的条带，分子量大小分别为：25kD、37kD、41kD、51kD、66kD、69kD、88kD、105kD、145kD、170kD、200kD；所述混合物的制备方法依次包括以下步骤：血浆收集、低温过滤、低温超滤、冷乙醇沉淀、SD灭活、离心、阴离子交换、第一次浓缩、分子筛、透析、第二次浓缩步骤；在所述低温过滤步骤中，在压力条件下将所述血浆进行过滤，得到滤液；其中，所述过滤使用的滤膜的孔径为0.22微米或0.45微米；在所述低温超滤步骤中，将所述滤液通过施加压力进行膜包超滤，得到截留在膜内的液体作为低温超滤产物；所述膜包截留分子量为3kD‑10kD，所述膜包超滤使用的缓冲液为180mM、pH值为8.0的Tris‑盐酸缓冲液；在所述冷乙醇沉淀步骤中，将所述低温超滤产物与冷乙醇混合后静置，取上清液，作为冷乙醇沉淀产物；所述冷乙醇和所述低温超滤产物的体积比为1：(4‑8)；在所述SD灭活步骤中，将所述冷乙醇沉淀产物用浓SD灭活剂重新悬浮后静置，得到灭活产物；所述静置温度为4～37℃，时间为6～18小时；所述浓SD灭活剂含有0.6‑4％的N‑丁基三磷酸盐、1‑4％的吐温；在所述离心步骤中，将所述灭活产物离心后保留上清液，得到离心分离产物；所述离心中，离心力为2000‑10000g，时间为10‑20分钟，温度为0‑8℃；在所述阴离子交换步骤中，将所述离心分离产物加入阴离子交换柱中进行步级洗脱，所述步级洗脱中，先用第一次洗脱缓冲液洗脱，得到第一次洗脱液；再用第二次洗脱缓冲液洗脱，得到废液；再用第三次洗脱缓冲液洗脱，得到第三次洗脱液；合并所述第一次洗脱液和第三次洗脱液，得到阴离子交换产物；所述第一次洗脱液缓冲液中含有50‑100mM的氯化钠，所述第二次洗脱液缓冲液含有250‑300mM的氯化钠，所述第三次洗脱液缓冲液含有450‑500mM的氯化钠；所述第一次洗脱缓冲液、第二次洗脱缓冲液、第三次洗脱缓冲液均为浓度100mM、pH值8.0的Tris‑盐酸缓冲液；所述第一次浓缩步骤中，将所述阴离子交换产物进行浓缩，得到第一次浓缩产物；所述第一次浓缩产物的体积为500微升‑10毫升；所述浓缩是采用浓缩管离心，所述浓缩管允许1.0‑2.5KD的物质通过；或者所述浓缩是采用浓缩杯加压，所述浓缩杯允许1.0‑2.5KD的物质通过；所述分子筛步骤中，将所述第一次浓缩产物在分子筛中洗脱，得到分子筛产物；所述洗脱的洗脱缓冲液中含有20‑500mM的氯化钠；所述洗脱缓冲液为Tris‑盐酸缓冲液，浓度为1mM，pH值为8.0；开始收集洗脱液时的洗脱体积为20ml，停止收集洗脱液时的洗脱体积为85ml；在所述透析步骤中，将所述分子筛产物进行透析，收集透析容器中的产物得到透析产物；所述透析使用的透析缓冲液为1‑20mM、pH值为8的Tris盐酸缓冲液；所述透析的时间为20‑72h；所述透析的体积比是1:(100‑10000)；在所述第二次浓缩步骤中，将所述透析产物进行第二次浓缩，得到第二次浓缩产物，即为所述混合物；所述透析产物的体积是所述浓缩产物的20‑100倍；所述浓缩是采用浓缩管离心，所述浓缩管允许1.0‑2.5KD的物质通过；或者所述浓缩是采用浓缩杯加压，所述浓缩杯允许1.0‑2.5KD的物质通过；通过蛋白质谱分析，所述混合物中至少含有105种蛋白；所述105种蛋白为：14‑3‑3蛋白ζ/δ、14‑3‑3蛋白质ε、40S核糖体蛋白S15、AP‑4复合物亚基β‑1、BPI折叠的家族B成员1、BPI折叠家族B成员2、DNA修复支架蛋白、Hemicentin‑1的同种型2、HORMA结构域蛋白2、Igλ链、LVV‑血管肽‑7、L‑乳酸脱氢酶B链、MOB激酶活化剂1B、NAD(P)转氢酶、Rho GDP‑解离抑制剂2、SLIT‑NTRK样蛋白4、S‑腺苷甲硫氨酸合酶、TNFSF4蛋白、α‑2‑HS‑糖蛋白、β‑2‑糖蛋白1、γ‑烯醇化酶、δLf乳转铁蛋白、玻连蛋白、博来霉素水解酶、补体C1q亚组分亚基C、补体C3、翅芽启动因子同源物、触珠蛋白、催乳素诱导蛋白、蛋白argonaute‑3的同种型2、蛋白S100‑A9、二甲基苯胺单加氧酶2、泛素‑60S核糖体蛋白L40、富含亮氨酸的α‑2‑糖蛋白、富酪蛋白、富唾液酸性脯氨酸磷蛋白1/2、肝细胞生长因子样蛋白、谷氨酰胺γ‑谷氨酰转移酶E、谷胱甘肽S‑转移酶P、谷胱甘肽过氧化物酶3、光蛋白聚糖、果糖二磷酸醛缩酶A、过位点蛋白2、过氧化物酶体膜蛋白PMP34、过氧物毒素2、核受体共活化剂1、琥珀酰‑CoA连接酶亚基α、肌动蛋白‑1、基本唾液富含脯氨酸蛋白2、甲状腺素结合球蛋白、钾电压门控离子通道、碱性肽IB‑6、结合高铁血红蛋白、精氨基琥珀酸合酶、聚合免疫球蛋白受体、赖氨酸‑tRNA连接酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸核糖甲酰基甘氨脒环连接酶、磷酸性簇排序蛋白2、酶原颗粒蛋白16同源物B、霉素、膜联蛋白、脑酸可溶性蛋白1、凝血酶2、凝血因子XIII B链、苹果酸脱氢酶、葡萄糖‑6‑磷酸1‑脱氢酶、前纤维蛋白同种型CRA_b、桥粒斑蛋白、桥粒芯糖蛋白‑1、人源性激肽释放酶结合蛋白、溶菌酶C、乳过氧化物酶、乳腺珠蛋白‑B、色素上皮衍生因子、上池蛋白、肾囊素‑3、视黄醇结合蛋白4、双功能3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸合酶1、丝氨酸蛋白酶抑制剂B12、丝聚蛋白、髓过氧化物酶的同工型H14、胎球蛋白B、微管蛋白α‑1A链、维生素D结合蛋白、烯醇化酶‑磷酸酶E1的同种型2、细胞外基质蛋白1、纤溶酶原、锌‑α‑2‑糖蛋白、锌指蛋白DZIP1L的同种型2、锌转运体、性激素结合球蛋白、血红蛋白、血浆激肽释放酶、血浆铜蓝蛋白、血清铁蛋白、血小板亲和蛋白、血小板亲和蛋白2的同种型1、原蛋白脂肪3、载脂蛋白A、粘蛋白‑5B、脂笼蛋白1样蛋白1、中性粒细胞防御素1、转化生长因子β受体相关蛋白1、组织蛋白酶D。