[发明专利]一种一管反应式的DNA分子克隆拼接方法

摘要

本发明提供了一种一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造方法，将目标DNA片段、桥接引物、多聚核苷酸激酶、热稳定性连接酶和反应缓冲液混合形成反应体系，缓冲液含有ATP、NAD⁺和Mg²⁺，pH值为6～10，通过一个热循环过程完成，本发明实现了在一管内一次性完成连接反应，且大大提高了连接反应效率，还具有以下优点：（1）DNA片段的磷酸化和拼接步骤在一管中一步完成连接反应，避免了使用磷酸化引物造成的高昂成本；（2）DNA片段无缝连接，不引入多余核苷酸；（3）非DNA序列依赖；（4）被拼接的DNA片段末端不引入其它核苷酸，DNA片段可重用于其他构建工作；（5）价格低廉，较常规的酶切连接方法成本低廉。

主权项

1.一种一管反应式的DNA分子克隆拼接或改造方法，其特征在于，将目标DNA片段、桥接引物、多聚核苷酸激酶、热稳定性DNA连接酶和反应缓冲液混合形成反应体系，将所述反应体系进行热循环反应获得完整连接产物，所述桥接引物的一段序列与一条目标DNA片段的磷酸化5’端互补配对退火，桥接引物的剩余一段序列与另一条目标DNA片段的去磷酸化3’端互补配对退火；所述多聚核苷酸激酶对单链或双链目标DNA片段的5’末端进行磷酸化，对3’末端进行去磷酸化；所述热稳定性DNA连接酶是对含有缺刻处的双链DNA的缺刻处进行连接；所述反应缓冲液含有ATP、NAD⁺和Mg²⁺；所述缓冲液的pH值为6～10；所述目标DNA片段与桥接引物的摩尔浓度比为1：0.1～100；所述热循环包括以下条件：80～105℃，0～2min高温变性、30～80℃，0～2min退火、30～80℃，0～10min延伸，循环数为1～60；所述ATP的浓度小于等于20mM、NAD⁺的浓度小于等于20mM，Mg²⁺的浓度小于等于100mM。