[发明专利]一种用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法

摘要

一种用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法，包括两个反应物的循环反应，分别是四氢叶酸循环反应和5，10‑甲基四氢叶酸循环反应；所述四氢叶酸循环反应为5‑甲基四氢叶酸与L‑高半胱氨酸反应生成四氢叶酸和L‑甲硫氨酸后，再以四氢叶酸为反应底物与甘氨酸和NAD+反应生成5，10‑甲基四氢叶酸和NADH；所述5，10‑甲基四氢叶酸循环反应为将四氢叶酸循环反应中生成的5，10‑甲基四氢叶酸为反应底物，与甘氨酸反应生成四氢叶酸和丝氨酸；通过检测340nm波长处NADH的吸光度上升程度，测算出L‑高半胱氨酸的浓度大小测定结果。该方法是以四氢叶酸为基础产生循环反应，通过累积生成NADH放大检测信号，在波长340nm进行测定，NADH与参与反应的同型半胱氨酸浓度成正比。 1

主权项

1.一种用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法，其特征是：包括两个反应物的循环反应，分别是四氢叶酸循环反应和5，10‑甲基四氢叶酸循环反应；所述四氢叶酸循环反应为5‑甲基四氢叶酸与L‑高半胱氨酸反应生成四氢叶酸和L‑甲硫氨酸后，再以四氢叶酸为反应底物与甘氨酸和NAD+反应生成5，10‑甲基四氢叶酸和NADH；所述四氢叶酸循环反应中，5‑甲基四氢叶酸与L‑高半胱氨酸反应生成四氢叶酸和L‑甲硫氨酸的反应步骤中，使用的酶为甲硫氨酸合成酶，所述反应的反应式为：5‑甲基四氢叶酸+L‑高半胱氨酸＝四氢叶酸+L‑甲硫氨酸；所述四氢叶酸循环反应中，以四氢叶酸为反应底物与甘氨酸和NAD+反应生成5，10‑甲基四氢叶酸和NADH的反应步骤中，使用的酶为氨基甲基转移酶；所述反应的反应式为：甘氨酸+四氢叶酸+NAD+＝5，10‑甲基四氢叶酸+NH3+CO2+NADH+H+；所述5，10‑甲基四氢叶酸循环反应为将四氢叶酸循环反应中生成的5，10‑甲基四氢叶酸为反应底物，与甘氨酸反应生成四氢叶酸和丝氨酸；所述5，10‑甲基四氢叶酸循环反应中，5，10‑甲基四氢叶酸与甘氨酸反应生成四氢叶酸和丝氨酸的反应步骤中，使用的酶为甘氨酸羟甲基转移酶；所述反应的反应式为：5，10‑甲基四氢叶酸+甘氨酸+H2O＝四氢叶酸+丝氨酸；通过检测340nm波长处NADH的吸光度上升程度，测算出L‑高半胱氨酸的浓度大小进而得出测定结果；所述的用于检测同型半胱氨酸的酶循环方法，其测试步骤为：S1:配制试剂盒：所述试剂盒试剂包含以下各组分：缓冲液Tris，反应底物5‑甲基四氢叶酸钙，反应底物甘氨酸，反应底物NAD+，酶激活离子MgCl2，甲硫氨酸合成酶，氨基甲基转移酶，甘氨酸羟甲基转移酶；所述步骤S1的试剂盒中各组分的浓度为：缓冲液Tris：20mM‑50mM；反应底物5‑甲基四氢叶酸钙：5mM‑10mM；反应底物甘氨酸：10mM‑20mM；NAD+：1mM‑5mM；酶激活离子MgCl2：2mM‑10mM；甲硫氨酸合成酶：5‑15kU/L；氨基甲基转移酶：1‑4kU/L；甘氨酸羟甲基转移酶：2‑6kU/L；S2：取步骤S1中的缓冲液Tris，溶解于纯化水中，并用浓盐酸调节pH值；S3：依次称取步骤S1中的5‑甲基四氢叶酸钙、甘氨酸、NAD+、MgCl2，并加入步骤S2的溶液中，搅拌至完全溶解；S4：取步骤S1中配制好的试剂甲硫氨酸合成酶、氨基甲基转移酶和甘氨酸羟甲基转移酶并各自单独溶解后，加入步骤S3所述的溶液中，搅拌混匀；S5：测定步骤S4的混匀溶液的pH值，并调节pH值，加入纯化水定容，然后过滤后置于2‑8℃备用；S6:将步骤S5中过滤后的溶液置于水浴平衡后得反应液，并配制浓度为0.05mM的L‑高半胱氨酸溶液作为检测物；S7：按反应液：检测物按比例，在生化分析仪上设定反应参数，并记录每一读点的吸光度，用于计算吸光度变化率。