[发明专利]重叠扩增子的选择性扩增

摘要

本发明涉及一种可扩展的多重PCR方法，可以同时扩增重叠扩增子而没有常规多重PCR的缺点。该方法选择性地扩增具有重叠区域的靶核酸片段。该方法包括步骤：获得包括第一标签t2和第一正向引物F1的第一核酸序列，获得包括第二标签t1和第一反向引物R1的第二核酸序列，获得包括第二标签t1和第二正向引物F2的第三核酸序列，获得包括第三标签t3和第二反向引物R2的第四核酸序列，其中每一个引物都是基因特异性引物；执行PCR的初始循环；以及接下来在更高的退火温度下执行PCR随后的循环，以获得扩增产物。

主权项

1.一种选择性扩增具有重叠区域的靶核酸片段的方法，包括步骤：(a)获得第一核酸序列，所述第一核酸序列包括第一标签(t2)和第一正向引物(F1)，所述第一正向引物与第一靶核酸片段互补，(b)获得第二核酸序列，所述第二核酸序列包括第二标签(t1)和第一反向引物(R1)，所述第一反向引物与所述第一靶核酸片段互补，(c)获得第三核酸序列，所述第三核酸序列包括所述第二标签(t1)和第二正向引物(F2)，所述第二正向引物与第二靶核酸片段互补，(d)获得第四核酸序列，所述第四核酸序列包括第三标签(t3)和第二反向引物(R2)，所述第二反向引物与所述第二靶核酸片段互补，其中所述第一靶核酸片段和所述第二靶核酸片段具有重叠核酸区域，F2与所述重叠核酸区域的一条链的5’端互补，R1与所述重叠核酸的另一条链的5’端互补，(e)混合所述第一靶核酸片段、所述第二靶核酸片段、所述第一核酸序列、所述第二核酸序列、所述第三核酸序列、所述第四核酸序列以及有效量的用于执行聚合酶链式反应(PCR)所必需的试剂；(f)通过PCR的变性、退火和引物延伸步骤对(e)的混合物循环至少两次，以及(g)在比步骤(f)中的退火温度高的退火温度下，通过PCR的变性、退火和引物延伸步骤对(f)的混合物循环以获得扩增产物，其中，步骤(g)中的退火温度高以防止最短的扩增子被主要扩增。